賴騰強(qiáng) 謝娜 吳伯文

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福建福州 350007）

靈芝為我國傳統(tǒng)名貴中藥，也是我國目前研究和開發(fā)較多的藥用菌[1]。《本草綱目》記載靈芝有“滋補(bǔ)強(qiáng)壯、延年益壽、利關(guān)節(jié)、治耳聾”等神奇功效，將其列為藥中上品[2]。靈芝含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、三萜、不飽和脂肪酸、生物堿、甾醇類物質(zhì)等[3]。其中靈芝多糖、三萜是主要藥效成分，靈芝多糖具有降“三高”、抗癌、提高免疫力等作用[4]；靈芝三萜具有保肝排毒、抑制腫瘤細(xì)胞、抗HIV 病毒、降低膽固醇、調(diào)血脂和抗炎等活性[5-6]。

靈芝的藥用價值被廣泛發(fā)掘，其市場需求快速增長，野生靈芝資源已遭到過度采摘和破壞，有些品種已瀕臨滅絕，保護(hù)野生靈芝種群及其生物遺傳多樣性，對野生靈芝的馴化栽培和仿野生栽培等技術(shù)手段進(jìn)行合理開發(fā)利用，具有重大意義[7]。野生靈芝可能具有栽培靈芝所沒有的優(yōu)良性狀，存在人們意想不到的優(yōu)良菌株，值得進(jìn)行深入研究[8-9]。

在福清市枇杷種植戶的枇杷園內(nèi)采集到一株野生黃褐色靈芝（圖1），對其進(jìn)行菌蓋內(nèi)菌肉組織分離，并進(jìn)行前端菌絲轉(zhuǎn)接，獲取較純的菌絲體，暫命名為農(nóng)芝1 號，現(xiàn)保藏于福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌栽培實(shí)訓(xùn)室。對野生靈芝農(nóng)芝1號進(jìn)行馴化栽培研究，了解其生物學(xué)特性、栽培特性及多糖、三萜含量，以期為進(jìn)一步開發(fā)農(nóng)芝1 號提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株農(nóng)芝1 號，由福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院組織分離、保藏；韓國靈芝、日本靈芝、美國靈芝、荷蘭紫芝、大紅芝，引自江蘇省高郵市科學(xué)食用菌研究所。

1.1.2 供試培養(yǎng)基母種培養(yǎng)基設(shè)4 個配方（自然pH），原種培養(yǎng)基設(shè)1 個配方，栽培袋培養(yǎng)基設(shè)2 個配方（表1）。原種、栽培袋培養(yǎng)基均添加輔料：麩皮10%、紅糖1%、石灰0.5%、過鈣0.5%，自然pH。

表1 供試培養(yǎng)基配方及滅菌要求

1.2 方法

1.2.1 野生靈芝組織分離及命名選取野生靈芝幼嫩的子實(shí)體，進(jìn)行菌蓋內(nèi)菌肉組織分離。在超凈工作臺內(nèi)，用 75%酒精棉球擦洗進(jìn)行表面消毒，用長柄手術(shù)刀切開野生靈芝子實(shí)體，分割成5.0 mm×5.0 mm 菌肉，并將菌肉接種在母種配方①培養(yǎng)基的斜面中間，放在培養(yǎng)箱中以25℃恒溫、暗光培養(yǎng)。

分離接種2～3 d 后菌肉周圍長出白色菌絲，8～10 d 后菌絲可長滿整個試管斜面。挑取無污染、菌絲潔白濃密、氣生菌絲多的試管，進(jìn)行前端菌絲轉(zhuǎn)接獲取較純的菌絲體，暫命名為農(nóng)芝1 號。

1.2.2 農(nóng)芝1 號生物學(xué)特性研究采用18 mm×180 mm 試管做容器，試管斜面長 8 cm。取5.0 mm×5.0 mm 菌塊接種在試管斜面中間，在25℃（溫度實(shí)驗(yàn)除外）的培養(yǎng)箱中暗光培養(yǎng)，各處理重復(fù)5 次。（1）溫度試驗(yàn)：采用母種配方①培養(yǎng)基，設(shè)7 個梯度溫度（5、10、15、20、25、30、35℃）。（2）濕度試驗(yàn)：采用原種培養(yǎng)基，設(shè)6 個梯度的濕度（60%、61%、62%、63%、64%、65%），試管裝料高8 cm。（3）pH 試驗(yàn)：采用母種配方①培養(yǎng)基，設(shè)8 個梯度的pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）。（4）營養(yǎng)試驗(yàn)：采用母種培養(yǎng)基，設(shè)置4 種不同的營養(yǎng)配方①②③④。定期測量菌落直徑，取平均值作衡量菌絲生長速度指標(biāo)；用肉眼觀察菌絲體生長粗壯、厚薄等情況，衡量其長勢[10]。

1.2.3 農(nóng)芝 1 號栽培特性研究采用17 cm×33 cm×0.05 cm 的聚丙烯塑料袋裝料，每袋料高14 cm，干料重385 g，經(jīng)高壓滅菌后待料溫降至25℃以下，按無菌操作規(guī)范接種。設(shè)6 個靈芝菌株，2 種不同的栽培袋配方A、B（表1）。（1）農(nóng)芝1 號出芝栽培試驗(yàn)的培養(yǎng)基采用栽培袋配方A；（2）6 個靈芝菌株栽培特性比較試驗(yàn)的培養(yǎng)基采用栽培袋配方B。用原種直接接種栽培袋，各接種50 袋。在溫度25℃、濕度65%～70%的走菌室暗光培養(yǎng)，適當(dāng)通風(fēng)。走菌期間，觀測蓋面時間、滿袋時間、菌絲長速、菌絲長勢等。

對農(nóng)芝1 號進(jìn)行出芝栽培試驗(yàn)：（1）袋子開口，在室內(nèi)自然溫度下栽培；（2）在室外桃樹下，脫袋覆土栽培。在初步了解農(nóng)芝1 號具有出芝能力后，與其他5 個不同靈芝菌株進(jìn)行栽培比較試驗(yàn)，比較不同菌株的栽培特性及靈芝多糖、三萜含量，從而了解農(nóng)芝1 號生長周期、出芝情況、生物學(xué)效率和多糖、三萜含量等，以此判斷農(nóng)芝1 號是否為優(yōu)良菌株。

當(dāng)菌絲長滿袋或有原基形成時，統(tǒng)一放入栽培室，在自然溫度下出芝，按參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行出芝管理。出芝期間，觀測現(xiàn)原基時間、分化時間、孢子彈射時間等。當(dāng)靈芝菌蓋邊緣的白邊變?yōu)楹稚珪r即可采收，采收后及時烘干至恒重，烘干溫度以不超過60℃為宜。采收期間，觀測采收時間、袋單產(chǎn)量、色澤、形狀、孢子量、菌柄長、菌蓋寬、菌蓋厚等。除產(chǎn)量記錄第1、2 潮外，其余數(shù)據(jù)只記錄第1 潮。計算生物學(xué)效率，其公式為：

式中：BE，生物學(xué)效率；Fdw，子實(shí)體干重；Sdw，基質(zhì)干重。

1.2.4 農(nóng)芝1 號活性成分研究委托福建仙芝樓生物科技有限公司，對配方A、B 栽培的第1 潮靈芝多糖、三萜含量進(jìn)行測定，按照中國藥典[12]的標(biāo)準(zhǔn)；其中，靈芝三萜以齊墩果酸、干基計，靈芝多糖以干基計。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)芝1 號生物學(xué)特性

獲得純菌絲體后，對農(nóng)芝1 號進(jìn)行生物學(xué)特性研究，了解其菌絲生長所需的溫度、濕度、酸堿度、營養(yǎng)條件等，從而為進(jìn)一步栽培創(chuàng)造條件。

2.1.1 不同溫度對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響由表2 可以看出，5℃時，農(nóng)芝1 號菌絲不萌發(fā)；溫度10～35℃菌絲均能生長，且隨著溫度的升高，菌絲萌發(fā)時間變早，生長速度加快，長勢趨好；溫度35℃時，菌絲生長速度減慢，長勢趨弱；其中溫度25～30℃，菌絲稠密，長勢旺；溫度30℃時，菌絲生長最快，菌絲長速達(dá)0.639 cm/d。

表2 不同溫度對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響

2.1.2 濕度對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響由表3可以看出，農(nóng)芝1 號菌絲在濕度60%～65%均能生長，菌絲萌發(fā)時間相差不大；濕度60%～63%，隨著培養(yǎng)基濕度增加，菌絲生長速度加快，長勢趨好；濕度64%～65%，隨著培養(yǎng)基濕度增加，菌絲生長速度減慢，長勢趨弱。濕度62%～63%，菌絲稠密，長勢旺；濕度63%時，菌絲生長最快，菌絲長速達(dá)0.522 cm/d。

表3 濕度對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響

2.1.3 不同pH 對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響由表4 可以看出，農(nóng)芝1 號菌絲在pH 5.0～8.5 均能生長；pH 5.0～6.5，隨著pH 增加，菌絲萌發(fā)時間變早，生長速度加快，長勢趨好；pH 7.0～8.5，菌絲萌發(fā)時間變長，生長速度減慢，長勢趨弱；pH 6.0～6.5，菌絲稠密，長勢旺；pH 為6.5 時，菌絲生長最快，菌絲長速達(dá)0.616 cm/d。

表4 不同pH 對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響

2.1.4 不同營養(yǎng)物質(zhì)對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響由表5 可以看出，農(nóng)芝1 號菌絲在供試培養(yǎng)基上均能生長，配方②④菌絲長勢最好，配方③較好，配方①長勢一般。配方④菌絲長速最快，達(dá)0.645 cm/d；其次是配方③（0.583 cm/d）；配方①菌絲長速最慢，只有0.456 cm/d。

表5 不同營養(yǎng)對農(nóng)芝1 號菌絲生長的影響

2.2 農(nóng)芝1 號栽培特性

出芝栽培試驗(yàn)結(jié)果表明，農(nóng)芝1 號具有出2潮靈芝的能力（圖2、3），脫袋覆土栽培的子實(shí)體（圖4）性狀正常，2 種方式所栽培出的農(nóng)芝1號子實(shí)體形態(tài)與野生靈芝基本相同。

2.2.1 不同靈芝菌株生長周期比較從表6 可知，供試靈芝菌株萌發(fā)時間一致，均為1 d，但生長周期有所不同。在蓋面時間上，美國靈芝最快，只需3 d；其次是農(nóng)芝1 號、日本靈芝、大紅芝，需3.5～4.0 d；荷蘭紫芝最慢，需要5.5 d。在滿袋時間上，美國靈芝最短，只需28.5 d；其次是大紅芝、日本靈芝，需31.5～32.5 d；荷蘭紫芝最慢，需要40.5 d。在菌絲長速上，美國靈芝最快，菌絲長速達(dá)0.558 cm/d；其次是大紅芝，為0.512 cm/d；荷蘭紫芝最慢，只有0.381 cm/d。在菌絲長勢上，日本靈芝、美國靈芝、大紅芝最好，其余的較好。在原基期上，大紅芝現(xiàn)原基最早，只需36 d；其次是日本靈芝、農(nóng)芝1 號，需38～39 d；美國靈芝最遲，需要47 d。在分化期上，農(nóng)芝1 號、大紅芝原基分化最早，只需55 d；其次是韓國靈芝、日本靈芝，需56～57 d；荷蘭紫芝最遲，需要66 d。在孢子期上，農(nóng)芝1 號彈射孢子最早，只需75 d；其次是韓國靈芝、美國靈芝，需76 d；最遲的是荷蘭紫芝，需要81 d。大紅芝采收期最早，只需90 d；其次是農(nóng)芝1 號、日本靈芝，需91～92 d；荷蘭紫芝最遲，需要103 d。

表6 不同靈芝菌株生長周期比較

2.2.2 不同靈芝菌株子實(shí)體形態(tài)特征比較從表7 可知，在形狀上，韓國靈芝為扇形，荷蘭紫芝為半圓形，其余均為腎形。菌柄長達(dá)到4 cm 以上的菌株有農(nóng)芝1 號、美國靈芝、大紅芝，最長的是農(nóng)芝1 號，達(dá)4.73 cm。菌蓋寬達(dá)到8 cm 以上的菌株有農(nóng)芝1 號、日本靈芝、大紅芝，最寬的是農(nóng)芝1 號，達(dá)9.17 cm。菌蓋厚達(dá)到1 cm 以上的菌株有農(nóng)芝1 號、日本靈芝、荷蘭紫芝、大紅芝，最厚的是大紅芝，達(dá)1.27 cm。在色澤上，荷蘭紫芝為紫黑色，其余均為黃褐色，農(nóng)芝1 號、大紅芝色澤最鮮艷（圖5、6），其余次之。在分枝量上，韓國靈芝、荷蘭紫芝最多，其次為日本靈芝、大紅芝，農(nóng)芝1 號、美國靈芝較少。在孢子量上，日本靈芝、美國靈芝最多，其次為農(nóng)芝1 號、韓國靈芝、大紅芝，荷蘭紫芝最少。

表7 不同靈芝菌株子實(shí)體形態(tài)特征比較

2.3 不同靈芝菌株生物學(xué)效率及活性成分比較

從表8 可知，農(nóng)芝1 號在枇杷枝屑（配方B）、雜木屑（配方A）上的產(chǎn)量、品質(zhì)有所差異，配方B 的生物學(xué)效率和多糖、三萜含量均高于配方A，生物學(xué)效率高0.32%，多糖含量高0.22%，三萜含量高0.25%。

表8 不同靈芝菌株生物學(xué)效率及活性成分比較

供試靈芝菌株在枇杷枝屑（配方B）上的產(chǎn)量、品質(zhì)也有所差異。在生物學(xué)效率上，大紅芝最高，為8.60%；其次是農(nóng)芝1 號，為7.56%；美國靈芝最低，為3.67%。在多糖含量上，大紅芝最高，為 7.42 mg/g，其次是農(nóng)芝 1 號，為6.68 mg/g；日本靈芝最低，為4.88 mg/g。在三萜含量上，大紅芝最高，為9.60 mg/g；其次是農(nóng)芝1 號，為9.27 mg/g；荷蘭紫芝最低，為6.51 mg/g。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)芝1 號在枇杷枝屑（配方B）的生物學(xué)效率和多糖、三萜含量均高于雜木屑（配方A），生物學(xué)效率高0.32%，多糖含量高0.22%，三萜含量高0.25%，表明利用枇杷枝屑作為培養(yǎng)基栽培靈芝能提高靈芝的產(chǎn)量和品質(zhì)，這與文獻(xiàn)[13-14]報道的相一致。

在不同營養(yǎng)對農(nóng)芝1 號菌絲的影響試驗(yàn)中，添加枇杷枝屑的配方②④較未加枇杷枝屑的配方①③菌絲長勢好、長速快，表明枇杷枝屑有利于農(nóng)芝1 號菌絲的生長，這與文獻(xiàn)[14-15]報道的相一致，具體是何種物質(zhì)促進(jìn)菌絲的生長，有待進(jìn)一步研究。

同時，農(nóng)芝1 號菌絲生長環(huán)境偏酸性，適宜pH 為6.0～6.5，這與文獻(xiàn)[16]報道的枇杷樹種植土壤以微酸性為最佳（土壤pH 6.0～6.5）相一致，表明農(nóng)芝1 號對枇杷枝屑產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性，枇杷樹適宜酸性土壤。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，供試靈芝菌株的第1 潮子實(shí)體分枝量較少，而第2 潮子實(shí)體的分枝量較多，究其原因，應(yīng)是袋子開口的問題，因此在栽培靈芝時，應(yīng)根據(jù)市場需求選擇是否袋子開口。

在子實(shí)體生長期間，給以一定的通風(fēng)量，子實(shí)體均不形成鹿角狀，而是形成片狀；而通風(fēng)量過小時，子實(shí)體不開片，呈鹿角狀。因此在栽培過程中，應(yīng)加強(qiáng)管理，注意調(diào)整通風(fēng)量，以栽培出商品性狀較好的靈芝子實(shí)體[17]。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列為高度可變區(qū)，進(jìn)化速度最快，能夠承受更多的變異，因此利用ITS 序列研究種的分類階元，其分子鑒定的結(jié)果可信，而ITS-RFLP 酶切片段是固定的，結(jié)果更可靠[18-19]。解凡等[8]、趙麗麗等[20]、鄒莉等[21]采用ITS 測序比對、ITS-RFLP 分子標(biāo)記等技術(shù)手段對野生靈芝進(jìn)行鑒定，對于農(nóng)芝1 號是否為新菌株，可采用ITS 測序、ITS-RFLP分子標(biāo)記等技術(shù)手段對其作進(jìn)一步鑒定。

生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：農(nóng)芝1 號菌絲生長適宜溫度為25～30℃，適宜濕度為62%～63%，適宜pH 為6.0～6.5。當(dāng)溫度為5℃時，菌絲不萌發(fā)，轉(zhuǎn)移至溫度25℃培養(yǎng)時，菌絲開始萌發(fā)且生長良好，表明可采用冰箱4℃低溫保藏菌種。

栽培特性比較研究結(jié)果表明：農(nóng)芝1 號菌絲4 d 蓋面，37 d 滿袋，菌絲長速為0.441 cm/d；39 d原基形成，55 d 原基分化，75 d 孢子彈射，91 d可采收第1 潮；腎形，菌柄長4.73 cm，菌蓋寬9.17 cm，菌蓋厚1.19 cm；色澤鮮艷，第1 潮靈芝分枝較少，孢子量較多；2 潮干芝總單重29.11 g，生物學(xué)效率7.56%，多糖含量6.68 mg/g，三萜含量9.27 mg/g。第2 潮靈芝分枝多，色澤鮮艷，適合靈芝盆景制作。

在發(fā)菌情況上，日本靈芝、美國靈芝、大紅芝較好，其次為農(nóng)芝1 號、韓國靈芝，荷蘭紫芝相對較差。在出芝時間上，農(nóng)芝1 號、日本靈芝、大紅芝較早；其次為韓國靈芝、荷蘭紫芝，美國靈芝相對較遲。在芝形上，農(nóng)芝1 號、大紅芝較好，其次為日本靈芝、荷蘭紫芝，韓國靈芝、美國靈芝相對較差；在孢子量上，日本靈芝、美國靈芝最多，其次為農(nóng)芝1 號、韓國靈芝、大紅芝，荷蘭紫芝最少。在產(chǎn)量上，大紅芝最高，其次為農(nóng)芝1 號，美國靈芝最低。在多糖含量上，大紅芝最高，其次為農(nóng)芝1 號，日本靈芝最低。在三萜含量上，大紅芝最高；其次為農(nóng)芝1 號，荷蘭紫芝最低。

在出芝栽培試驗(yàn)和栽培比較試驗(yàn)中，農(nóng)芝1號發(fā)菌情況、出芝時間、芝形、孢子量、產(chǎn)量及多糖、三萜含量等方面相差不大，且馴化栽培的子實(shí)體形態(tài)與野生靈芝基本相同，說明農(nóng)芝1 號具有穩(wěn)定的遺傳性。

綜上所述，農(nóng)芝1 號在菌絲生長周期、子實(shí)體性狀及多糖、三萜含量等綜合評價指標(biāo)上，表現(xiàn)出菌絲生長較快、出芝較早、芝形較好、孢子量較多、產(chǎn)量較高及多糖、三萜含量較高等良好性狀，該菌株既適合藥用栽培又適合培育盆景，且遺傳性穩(wěn)定。因此，農(nóng)芝1 號是適合栽培的優(yōu)良菌株，具有潛在的開發(fā)利用價值，可用于進(jìn)一步推廣栽培。