鐘禮義，陳體強(qiáng)，劉新銳，應(yīng)正河，楊 馳

（1.福建武平縣食用菌技術(shù)推廣服務(wù)站，福建 武平 364300；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州350014；3.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】靈芝的商品化栽培（規(guī)范化種植）起源于20 世紀(jì)90 年代，福建省曾大力推廣以赤芝6 號(hào)等為代表的優(yōu)良栽培菌株[1-2]，成為國(guó)內(nèi)最大的靈芝生產(chǎn)與出口基地。但2000 年以來(lái)，福建靈芝種植業(yè)受?chē)?guó)家林業(yè)政策等影響，栽培用材短缺難以維持商品化種植的需求（人工培育靈芝專(zhuān)用林的成材期長(zhǎng)達(dá)10—12 年），栽培量一落千丈。同時(shí)，長(zhǎng)期以來(lái)人工栽培和加工利用的靈芝種類(lèi)（品種）單一，難以滿(mǎn)足多樣化的市場(chǎng)需要，產(chǎn)業(yè)發(fā)展缺乏新的增長(zhǎng)點(diǎn)。而野生紫芝種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用及其人工馴化栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用，可再次促進(jìn)福建省靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，能成為山區(qū)扶貧致富的好項(xiàng)目。福建省靈芝科真菌資源中靈芝屬的紫芝類(lèi)（Sect.Phaeonema）有9 種[3]，其代表性種類(lèi)是被稱(chēng)為中國(guó)靈芝的紫芝（G.sinense）、其近緣種的硬孔靈芝（G.duropora）[4]，這2 種紫芝常見(jiàn)于閩西北山區(qū)。【前人研究進(jìn)展】紫芝是靈芝科靈芝屬（Ganoderma）的重要類(lèi)群紫芝組（Sect.Phaeonema），其特征是菌肉呈均勻褐色、深褐色至栗褐色；以Ganoderma sinense為中心的紫芝大種群是屬于高溫多雨氣候型，分布在長(zhǎng)江以南的8 個(gè)省區(qū)[5]。相較于栽培較廣泛的赤芝（G.1ucidum）與松杉靈芝（G.tsugae），紫芝種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用相對(duì)滯后，市場(chǎng)上的靈芝或者靈芝類(lèi)產(chǎn)品很少以紫芝為主要原料[6]。紫芝作為中藥材靈芝來(lái)源菌物，自2000 年起被《中國(guó)藥典》收錄，但其栽培種質(zhì)資源與遺傳育種方面的研究報(bào)道較少，亟待加強(qiáng)。目前，我國(guó)人工栽培的紫芝菌種主要還是野外分離和馴化的菌株[7]，如閩紫96 和紫芝S2[8-9]。這2 個(gè)栽培菌株在栽培性狀（朵型、大?。┗蜃訉?shí)體發(fā)育形態(tài)上有著很大的不同，其中閩紫96 菌蓋小型，菌柄側(cè)生、偏生為主，栽培單產(chǎn)僅有12.70 kg· m-3（干 品/菌 材），而 紫 芝S2 菌蓋 大 型，菌柄中生、近中生，栽培單產(chǎn)平均可達(dá)25.05 kg·m-3（干品/菌材）。國(guó)內(nèi)外學(xué)者根據(jù)（微觀和宏觀）形態(tài)特征上的不同，早在2005 年就描述了紫芝（G.sinense）的表型可塑性[10]，且基于系統(tǒng)發(fā)育分析，已有研究者提出將硬孔靈芝（G.duropora）與紫芝（G.sinense）歸類(lèi)為一個(gè)新的復(fù)合種——紫芝（Ganoderma duroporum comb.nov.）[11]。最近，來(lái)自中國(guó)境內(nèi)不同產(chǎn)地的具有高度表型可塑性的20 份紫芝標(biāo)本，從多基因序列比對(duì)結(jié)果也被證實(shí)為同一種[12]。【本研究切入點(diǎn)】經(jīng)多年多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn)和Finlay 穩(wěn)定性分析，紫芝S2 受栽培環(huán)境因素影響較?。ǚ€(wěn)定性好，適應(yīng)性強(qiáng)），于2012 年獲得新品種認(rèn)定（品種認(rèn)定號(hào)：閩認(rèn)菌2012002），定名為武芝2 號(hào)[13]。紫芝S2 適于林下種植與大棚栽培，已在福建省閩西北推廣應(yīng)用多年，年產(chǎn)量可達(dá)300 t；近年來(lái)，紫芝S2 已經(jīng)被引種至廣東、廣西、江西和浙江等省份，遼寧、黑龍江也有星零種植。為了避免與其他來(lái)源（遺傳背景不同）栽培菌的株系混雜，本研究采用RAPD-PCR、ISSR-PCR 技術(shù)構(gòu)建紫芝S2（Zizhi S2）的分子標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】應(yīng)用Primer-Blast 在線(xiàn)設(shè)計(jì)，將篩選得到的特異性PCR 引物短序列與紫芝S2 基因組全序列進(jìn)行Blast 比對(duì)，反向驗(yàn)證其有效性，為紫芝菌株鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從不同單位得到的6 個(gè)紫芝栽培常用紫菌株（表1）。其中，1 號(hào)菌株紫芝S2 和2 號(hào)菌株紫芝X5均由福建省武平縣食用菌技術(shù)推廣服務(wù)站選育提供。紫芝S2 與紫芝X5、紫芝1、紫芝2、紫芝3、紫芝4等其他5 個(gè)菌株間均存在不同度的拮抗現(xiàn)象，菌絲表面形成帶狀拮抗線(xiàn)（圖1）。

表1 供試紫芝菌株信息Table 1 Strains of cultivated Zizhi used in study

1.2 DNA 樣品提取與檢測(cè)

將供試菌株分別接種到貼有玻璃紙的PDA 平板中，封口倒置、于27 ℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板收集菌絲，于預(yù)冷研缽中加入液氮研磨成細(xì)粉，采用改良CTAB法提取和純化總DNA[14]。采用0.75%瓊脂糖凝膠電泳（100 V 直流1 h，5～80 kb 脈沖16 h）檢測(cè)DNA樣品符合建庫(kù)合格，Nanodrop 檢測(cè)DNA 純度（161.6 ng·μL-1），Qubit 快速熒光定量（154.0 ng·μL-1）。

1.3 RAPD、ISSR 擴(kuò)增分析比較

采用Eppendorf Mastercyeter Personal PCR 擴(kuò)增儀，PCR 試劑購(gòu)自TaKaRa 有限公司（大連），候選RAPD、ISSR 擴(kuò)增引物均從（上海）生工生物工程股份有限公司提供的引物產(chǎn)品中篩選，PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序按照參考文獻(xiàn)[14]。反應(yīng)結(jié)束后，各取5 μL PCR 產(chǎn)物，加1 μL 溴酚藍(lán)（6×）混勻，在1.0%瓊脂糖凝膠（含Goldview TMDNA 染料0.5 μg·mL-1）上電泳，使用Marker 為DL2000，于4～5 V·cm-1電壓下電泳約1.0 h，在JS-680 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照保存。

1.4 引物序列與基因組序列的比對(duì)

采用PacBio Sequel 三代測(cè)序平臺(tái)完成紫芝S2 全基因組測(cè)序，組裝得到72 條Scaffold（其中核基因組71 條，另文報(bào)道）；Blast 比對(duì)（BLAST, v2.2.26）檢測(cè)每條Scaffold 上是否包含RAPD、ISSR 引物的短序列，并統(tǒng)計(jì)不同錯(cuò)配比對(duì)結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理方法

多態(tài)位點(diǎn)百分率計(jì)算公式為P =（k/n）×100%，k 為多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，n 為檢測(cè)位點(diǎn)總數(shù)；遺傳相似距離計(jì)算采用Nei 氏公式S = 2Nxy/（Nx+ Ny），其中Nxy為菌株X 和Y 共有片段數(shù)，Nx、Ny分別為X 和Y 菌株擴(kuò)增片段總數(shù)。采用NTSYSpc2.0 軟件對(duì)菌株RAPD、ISSR 分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析，生成供試菌株的遺傳聚類(lèi)關(guān)系圖。選取比對(duì)允許空位數(shù)為0 的Blast 結(jié)果（比對(duì)分?jǐn)?shù)值Score 越大越好，e 值越小越好），采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，分成比對(duì)允許錯(cuò)配為0 和1（即Gap=0；Mismatch=0, 1）兩類(lèi)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒別菌株的分子標(biāo)記短序列

篩選到2 個(gè)RAPD 引物：S1506（GGTGGCCA AG）和S1326（AGGCATCGTG），其擴(kuò)增效果較好、重復(fù)性高，能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出特異性的條帶；其中，在紫芝S2、X5 的圖譜中分別呈現(xiàn)明顯區(qū)別的1～3特異性條帶，并且與4 個(gè)對(duì)照菌株的條帶均能明顯差異（圖2）。同時(shí)，還篩選到3 個(gè)ISSR 引物：ISSR1（C ACCACACACACACACA）、ISSR2（AGAGACAGAG AGAGAGT）和ISSR13（TTCCCTTCCTTCCC），其擴(kuò)增效果好、條帶清晰且穩(wěn)定，呈現(xiàn)多態(tài)性；共擴(kuò)增出87 條帶，其中表現(xiàn)出多態(tài)性的條帶為59 條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為67.82%。其中，紫芝S2、X5 彼此間呈現(xiàn)1～3 條特異性條帶，也能與4 個(gè)對(duì)照菌株的條帶明顯區(qū)別開(kāi)來(lái)（圖3）。分析結(jié)果表明：采用S1506、S1326、ISSR1、ISSR2、ISSR13 共5 個(gè)短序列引物，擴(kuò)增得到RAPD 和ISSR 圖譜，均能夠簡(jiǎn)單而有效地將紫芝S2 與其他紫芝菌株鑒別，可以考慮用于分子標(biāo)記。

圖1 紫芝菌株間的拮抗現(xiàn)象Fig.1 Antagonism between different Zizhi strains

圖2 RAPD-PCR 擴(kuò)增圖譜Fig.2 RAPD-PCR amplifications

2.2 不同紫芝菌株間的遺傳距離

通過(guò)聚類(lèi)分析建立遺傳相似距離矩陣，得到聚類(lèi)圖（圖4）。結(jié)果表明，6 株菌株相互間的遺傳相似距離在0.564～0.836；其中，1 號(hào)菌株（紫芝S2）與4 號(hào)菌株（紫芝2）之間的親緣關(guān)系最近，而與5 號(hào)菌株（紫芝3）之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。已知紫芝S2 與紫芝2 之間拮抗不明顯，而與紫芝3 之間拮抗明顯（圖1），這2 個(gè)試驗(yàn)結(jié)果相印證。

2.3 RAPD 和ISSR 引物序列與基因組的比對(duì)結(jié)果

圖3 ISSR -PCR 擴(kuò)增圖譜Fig.3 ISSR-PCR amplifications

圖4 紫芝菌株的遺傳聚類(lèi)圖Fig.4 Clustering dendrogram of Zizhi strains

將篩選得到5 個(gè)引物短序列（標(biāo)為*_堿基數(shù)：S1506_10、S132610、ISSR1-17、ISSR2_17 和ISSR13_14）與紫芝S2 的基因組序列進(jìn)行Blast 比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除ISSR1_17 外，其他4 個(gè)引物都能比對(duì)上，均在基因組中不同Scaffold 上的多個(gè)位點(diǎn)找到與引物相匹配的序列片段（表2）。在允許一個(gè)（單堿基）錯(cuò)配或空位情況下，在18 條Scaffold 上有31 個(gè)片段（17 bp）與ISSRPCR 引物ISSR2_17 相匹配（Identity=93.75～94.12），同時(shí)在18 條Scaffold 上找到31 個(gè)片段（14 bp）與ISSR13_14（完全匹配Identity=100），在48 條Scaffold上找到158 個(gè)片段（10 bp）與S1326_10 匹配（Identity=100%），在47 條Scaffold 上找到172 個(gè)片段（10 bp）與S1506_10（Identity=100%）相匹配。如不允許錯(cuò)配或空位，則在5 條Scaffold 上有6 個(gè)片段（14 bp）與引物ISSR13_14 完全匹配（Identity=100%），在48 條Scaffold 上發(fā)現(xiàn)共有158 個(gè)片段（10 bp）與引物S1326_10 完全匹配，在47 條Scaffold 上共有172個(gè)位點(diǎn)片段（10 堿基）與S1506_10 完全匹配。因此，本研究最終推薦ISSR13、S1326 和S1506 這3 個(gè)PCR 引物作為鑒別紫芝菌株的分子標(biāo)記。

表2 PCR 引物與基因組比對(duì)結(jié)果Table 2 Blast result of PCR primer sequences on genomes

3 討論與結(jié)論

已知在靈芝屬藥用真菌的遺傳多樣性研究中可以通過(guò)拮抗反應(yīng)進(jìn)行初步分類(lèi)，然后再通過(guò)分子生物學(xué)的方法進(jìn)行深入研究[15～17]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫芝S2 菌株與其他紫芝菌株之間存在拮抗反應(yīng)，遺傳背景明顯不同的個(gè)體在菌絲交界區(qū)會(huì)形成明顯的拮抗線(xiàn)，可以據(jù)此進(jìn)行少量紫芝菌株的初步分類(lèi)與鑒別；但當(dāng)菌株數(shù)量眾多時(shí)，工作量大且無(wú)法量化而不適用。本研究通過(guò)篩選到有價(jià)值的2～3 個(gè)RAPD/ISSR 引物，PCR 擴(kuò)增得到的DNA 片段呈現(xiàn)條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性和特異性的電泳指紋圖譜，可用于紫芝新品種武芝二號(hào)（紫芝S2）與其他5 個(gè)紫芝菌株的鑒別。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)遺傳距離確定其親緣關(guān)系，與菌株間的拮抗反應(yīng)相一致；進(jìn)一步通過(guò)與紫芝S2 菌株基因組序列比對(duì)，確認(rèn)利用其中3 個(gè)引物（ISSR13、S1326 和S1506）作為鑒別紫芝栽培品種或菌株簡(jiǎn)單有效的分子標(biāo)記物。

2012 年以來(lái)公布的幾種靈芝核基因組[18～21]，其中組裝質(zhì)量高和注釋信息較完整的有赤芝基因組全序列總長(zhǎng)43.29 Mb（82 條Scaffolds, 16 113 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因）[19]，紫芝基因組全序列總長(zhǎng)48.96 Mb（69條Scaffolds, 15 688 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因）[20]；本研究同期完成紫芝S2 三代測(cè)序，組裝得到的核基因組序列全長(zhǎng)56.76 Mb，包含71 條Scaffolds，注釋出16 681 蛋白質(zhì)編碼基因（另文報(bào)道）。在此基礎(chǔ)上，既可以基于靈芝基因組序列篩選出有效SSR 位點(diǎn)用于快捷、準(zhǔn)確地標(biāo)記區(qū)分靈芝菌株間親緣關(guān)系（另文報(bào)道），也可以將篩選得到的有效鑒別紫芝菌株的RAPD/ISSR-PCR 引物（短序列）與紫芝基因組序列進(jìn)行Blast 比對(duì)驗(yàn)證。

致謝：本研究依托特色食用菌繁育與栽培國(guó)家地方（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）聯(lián)合工程研究中心、福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心的科研平臺(tái)完成。