朱 屹，李俊良，焦 博，朱倩倩，張小梅

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東 青島 266109）

0 引言

【研究意義】聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO）統(tǒng)計結(jié)果表明，2016 年中國的番茄（Solanum lycopersicum L.）產(chǎn)量超過5 600 萬t。與高產(chǎn)作物同時產(chǎn)生的還有近1.3 億t 的番茄殘株，這些有機廢物亟需妥善處理[1]。堆肥是處理農(nóng)業(yè)廢棄物的有效手段之一。然而，傳統(tǒng)堆肥發(fā)酵工藝持續(xù)時間長、效率低，蔬菜秸稈較農(nóng)作物秸稈具有的高木質(zhì)素含量更是加劇了這一問題[2]。同時，由于堆肥發(fā)酵是一個微生物生態(tài)學(xué)過程，物料來源及組成的不同，如蔬菜秸稈較糧食作物秸稈具有更高的含水率、更低的C/N 且富含氮磷鉀等植物必需營養(yǎng)元素，將使得其內(nèi)直接或間接作用的微生物種類差異較大[3]。因此，針對蔬菜秸稈開展具體的堆肥化研究，并有效探明影響腐解的關(guān)鍵微生物及其功能，對進一步優(yōu)化其發(fā)酵工藝具有重要作用[4]?！厩叭搜芯窟M展】前人對秸稈類廢棄物堆肥化過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化研究，多集中在利用保守標(biāo)記基因（如16S rRNA 等）指紋圖譜為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)手段。如賈洋洋等[5]利用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)研究了玉米秸稈堆肥中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化；Liu 等[6]利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)檢測了番茄秸稈堆肥過程中，不同調(diào)理劑（生物炭、泥炭沼、沸石等）的添加對細(xì)菌群落多樣性及其組成的影響。高通量焦磷酸測序技術(shù)的產(chǎn)生，為定性、定量地表征生態(tài)系統(tǒng)中全部的微生物群落信息提供了可能。該方法靈敏度較高，已被廣泛應(yīng)用于各種復(fù)雜生境研究中[7-8]。然而，高通量測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)信息無法表征微生物活性。近年來，新興的宏蛋白質(zhì)組學(xué)（Metaproteomics）技術(shù)則可以原位（in situ）分析微生物的催化活性[9]，而整合了焦磷酸測序和宏蛋白質(zhì)組學(xué)的整合宏組學(xué)方法（Integrated meta-omics）則將微生物的群落結(jié)構(gòu)及其功能聯(lián)系了起來[10]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，整合宏組學(xué)方法已成功應(yīng)用于多種生態(tài)系統(tǒng)研究中[8]，但尚未見將其應(yīng)用于蔬菜廢棄物處理的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究首次將整合宏組學(xué)方法應(yīng)用于番茄秸稈堆肥中，用以揭示堆肥發(fā)酵期關(guān)鍵微生物的群落結(jié)構(gòu)、主要的降解酶類及關(guān)鍵微生物的功能，為針對番茄秸稈微生物菌劑的有效復(fù)配提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 物料來源

所用新鮮番茄秸稈取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園周邊農(nóng)場；用于調(diào)節(jié)堆肥參數(shù)的輔料——玉米秸稈直接來源于農(nóng)業(yè)示范園內(nèi)。物料的基本性質(zhì)如表1 所示。

表1 堆肥原料的理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of raw materials for composting

1.2 堆肥試驗

堆肥試驗于2017 年6～7 月在山東省青島膠州市青島農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)（120.1°E，36.4°N）內(nèi)進行。先將番茄秸稈和玉米秸稈切成2～5 cm 的小段，然后按番茄秸稈和玉米秸稈有機碳為56%，總氮分別為2.8%和0.6%計算，二者按3∶1（m∶m）的比例混合，混合物料C/N 約為25∶1，調(diào)節(jié)物料含水率為50%～65%，堆成長×寬×高約為5.5 m×1.5 m×1.5 m 的條垛，進行條垛式堆肥研究。

1.3 取樣方法

堆肥試驗共持續(xù)5 周。在發(fā)酵堆建堆開始后的第1、2、3、4、5 周（即第7、14、21、28、35 d）分別于堆體20～50 cm 深處、采用“五點取樣法”采集樣品，樣品混勻后分成兩部分。一部分自然風(fēng)干用于理化性質(zhì)的測定，一部分立刻-20 ℃凍存，用于提取樣品總DNA 和酶液的制備、酶學(xué)性質(zhì)分析。

1.4 理化性質(zhì)測定

為監(jiān)測發(fā)酵堆溫度的變化，將5 個1 m 長的溫度計從堆體不同的方向和位置分別插入20～50 cm 深，每天同一時刻（14:00）記錄堆體內(nèi)部溫度，其平均值作為發(fā)酵堆每日溫度；同時記錄每日環(huán)境溫度的變化。物料含水率的測定根據(jù)所取樣品（10 g）在105℃下烘干過夜減少的重量計算得出。樣品pH值通過將樣品與去離子水按1∶9（W / V）配制，在240 r·min-1下 機 械 振 動1 h 并 靜 置30 min 后，用pH 計（Ultra Basic-7，US）測定其上清液所得。利用外加熱重鉻酸鉀法測定樣品的有機質(zhì)含量[11]，有機質(zhì)含量除以換算系數(shù)1.724 得到有機碳量[12-13]。樣品的總氮量由凱氏定氮法測定[14]。

1.5 DNA 提取和焦磷酸測序

按照PowerSoil DNA Kit 使用說明提取堆肥樣品的基因組DNA，每個樣品重復(fù)3 次。DNA 濃度用Nanodrop（Oxfordshire，UK）在260 nm 波長下測定。質(zhì)檢后的DNA 作為序列擴增用模板，分別用條碼融合探針338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）覆蓋V3～V4 高變區(qū)擴增16S rDNA 基因片段[15]；用1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer, ITS）rDNA 基因片段[16]。16S rDNA 和ITS rDNA 基因擴增體系和條件按文獻[17]進行。將擴增產(chǎn)物統(tǒng)一成等摩爾濃度，用 ABI GeneAmp 9 700（Applied Biosystems, Foster City，CA，USA）和羅氏GS FLX 平臺（Roche Life Sciences，Indianapolis，IN，USA）測試分析。通過QIIME（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）對所得序列信息進行質(zhì)控。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分類

質(zhì)控后的序列信息利用UPARSE 方法進行讀長聚類，定義序列相似度≥97%的序列為一個操作分類單元（Operational taxonomic unit, OTU）。16S rDNA 和ITS rDNA 序列比對的參考數(shù)據(jù)庫分別為Silva（http://www.arb-silva.de）和ITS rRNA（http://unite.ut.ee/index.php）。

1.7 酶活測定及統(tǒng)計分析

粗酶液按文獻[18]所述方法制備。蛋白酶活性采用Folin-酚法[19]；內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶活性采用二硝基水楊酸（DNS）法測定[20]。所有試驗均重復(fù)3 次。以相對酶活性（同一實驗條件下，各吸光度與最大吸光度的比值）表征各酶活性隨時間的變化。酶活性與主要微生物屬（平均相對豐度＞1%）間的Pearson 相關(guān)系數(shù)通過SPSS v20.0（SAS Inc., USA）計算，并設(shè)定P＜0.05 和P＜0.01 為顯著相關(guān)和極顯著相關(guān)。

1.8 蛋白提取和宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析

取第3 周的堆肥樣品用于宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析。將25 g 堆肥樣品、100 mL 去離子水混勻后，置于4 ℃浸提24 h，4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并通過0.22 μm 濾膜過濾。濾液再分別通過3 kDa的超濾管（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）超濾濃縮、三氯乙酸沉淀、雙蒸水重懸成適當(dāng)濃度后，按張麗麗等[7]的方法進行胰酶消化和脫鹽。獲得的肽溶解于10 μL 50%（V / V）乙腈和0.1%（V / V）三氟乙酸溶液中，并通過LTQ-Orbitrap-MS/MS（Thermo Fisher, Pittsburg.PA，USA）進行質(zhì)譜鑒定。樣品酶解后的肽段通過2000 V 的電壓噴入質(zhì)譜儀，轉(zhuǎn)移毛細(xì)管的溫度為275 ℃。所得數(shù)據(jù)通過Xcalibur 2.2.0（Thermo Fisher Scientific）進行分析。

1.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

從Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）中下載第3 周堆肥樣品中豐度較高的幾個優(yōu)勢細(xì)菌屬和優(yōu)勢真菌屬（Thermomyces）的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)信息，形成質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對的參考數(shù)據(jù)庫。用Proteome Discovered software 1.4（Thermo Fisher Scientific）對數(shù)據(jù)進行比對分析。錯配閾值設(shè)為0.05。設(shè)定當(dāng)某蛋白在第3 周堆肥樣品的3 個重復(fù)中被檢測到兩次及以上時，認(rèn)為該蛋白存在，3 個平行樣的光譜數(shù)（Spectrum count）平均值作為該蛋白的平均相對豐度[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥表觀變化

為監(jiān)測發(fā)酵堆的表觀變化，堆體在第一次取樣時進行了縱剖。發(fā)現(xiàn)表層（0～20 cm）樣本干燥且相對完整；中間層（20～50 cm）有白色菌絲明顯可見；而底層（＞50 cm）白色菌絲消失。這種分層現(xiàn)象在之前的文獻中也有報道[8]，表明在沒有翻堆的情況下，中間20～50 cm 深度范圍內(nèi)最適合微生物生長[22]。因此，采集該層樣品深入分析。

2.2 溫度和酶活性的變化

堆溫在第1 d 時就迅速由28 ℃升高到55 ℃，且在整個監(jiān)測期內(nèi)溫度都高達(dá)50 ℃以上（圖1-a），說明高溫堆肥試驗成功。監(jiān)測了與碳氮代謝相關(guān)主要酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)蛋白酶在第7 d 時活性較高，之后下降，至第3 周時酶活性最高，之后又快速下降；而作為植物生物質(zhì)降解的主要酶類，內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶在開始的前3 周內(nèi)酶活性不斷上升，之后下降（圖1-b）。這與堆肥初期先降解可溶性有機物，堆溫快速上升；然后再對較難降解的纖維素和半纖維素類物質(zhì)降解的規(guī)律是一致的[23]。由于第3 周時碳氮代謝主要酶的活性最高，故對該周樣品進行了后續(xù)高通量焦磷酸測序和Orbitrap 宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

圖1 堆肥溫度（a）和主要酶活力（b）的變化Fig.1 Changes on temperature （a） and activities of primary enzymes （b） in compost

2.3 微生物群落組成

對第3 周3 個重復(fù)樣品進行高通量測序，質(zhì)控后分別獲得26 898、30 863 和28 457 條16S rDNA 序列和59 845、61 299、60 128 條ITS rDNA 序列；這些序列分別對應(yīng)679、703 和681 個細(xì)菌OTU 及259、276 和297 個真菌OTU。細(xì)菌OTU 被歸為6 個主要的門（平均相對豐度＞1%）。豐度最高的前4 個門分別為變形菌門Proteobacteria（37.2%）、厚壁菌門Firmicutes（26.4%）、放線菌門Actinobacteria（23.0%）和擬桿菌門Bacteroidetes（8.25%）（圖2-a），這與之前的文獻報道基本一致[24]。其中，放線菌門下主要的屬為嗜熱裂孢菌屬Thermobifida（16.5%）和糖單孢菌屬Saccharomonospora（1.36%）；變形菌門下主要的屬為海源菌屬Idiomarina（15.6%）；厚壁菌門的代表屬有Limnochordaceae norank（5.40%）、芽孢桿菌屬Bacillus（4.25%）和嗜熱桿菌屬Thermobacillus（1.91%）；黃桿菌屬Flavobacterium（2.37%）是擬桿菌門的典型代表（圖2-c）。相對于細(xì)菌群落而言，真菌的群落結(jié)構(gòu)要簡單得多。子囊菌門Ascomycota占絕對統(tǒng)治地位，比例為81.3%（圖2-b），其中嗜熱真菌屬Thermomyces 為優(yōu)勢真菌屬（相對豐度70.5%）（圖2-b）。

對照整個發(fā)酵過程中主要（平均相對豐度＞1%）微生物的群落結(jié)構(gòu)變化（圖3），可以看出，海源菌屬Idiomarina 是第1 周時的主要細(xì)菌屬（相對豐度11.6%），第2 周時基本檢測不到，至第3 周時相對豐度又提高至15.6%。第2 周時主要細(xì)菌屬為Limnochordaceae norank（17.9%）和氫化菌屬Hydrogenispora（14.9%）。嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 和嗜熱真菌屬Thermomyces在發(fā)酵開始后豐度逐漸提高。嗜熱裂孢菌屬Thermobifida第1 周時僅為1.4%，至第2 周時已升至8.9%；嗜熱真菌屬Thermomyces 也由開始時的10.0%提高至61.1%。至第3 周時，二者豐度分別升至16.5%和70.5%，成為該時期的主導(dǎo)細(xì)菌和真菌屬。之后二者豐度逐漸降低，至發(fā)酵結(jié)束時，相對豐度僅為1%左右。

2.4 宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析

從圖1-b 可以看出，第3 周時植物生物質(zhì)降解相關(guān)的酶（內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶）活性最高，秸稈降解的主要功能微生物代謝最為旺盛，對該時期樣品進行質(zhì)譜鑒定更能快速定位秸稈降解的關(guān)鍵微生物[7-8]。利用LTQ-Orbitrap-MS/MS 對第3 周的堆肥樣品進行分析，所得數(shù)據(jù)與主要的微生物屬（圖2-c）蛋白質(zhì)組進行比對，發(fā)現(xiàn)嗜熱裂孢菌屬Thermobifida是堆肥中的主要功能微生物。堆肥樣品中鑒定到的纖維素酶全部由嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 產(chǎn)生，同時還鑒定到源于該屬的一種木聚糖酶（P74912）、一種果膠裂解酶（Q47MW8）和兩種具有纖維素結(jié)合能力的蛋白（Q47PB9 和Q47QG3）（表2）。以上結(jié)果說明，嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 在纖維素的結(jié)合與降解、半纖維素的降解和果膠裂解過程中發(fā)揮重要作用，是堆肥有機質(zhì)形成的主要參與者，這與之前的文獻報道是一致的[7]。

圖2 第三周堆肥樣品中細(xì)菌門（a）、真菌門（b）及主要屬（平均相對豐度＞1%，c）組成Fig.2 Microbes by bacterial phylum (a), fungal phylum (b) and genera with average relative abundance greater than 1% (c) in 3-week compost sample

鑒定到的木聚糖酶產(chǎn)生者，除嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 外， 還有放線菌門的糖單孢菌屬Saccharomonospora；厚壁菌門的清野氏菌Planifilum及子囊菌門的嗜熱真菌屬Thermomyces，三者所產(chǎn)木聚糖酶的家族和登錄號分別為GH10 家族的I1C XX6、GH35 家 族 的A0A1I2PGX8 和GH11 家 族 的O43097（表2）。清野氏菌Planifilum 隸屬于高溫放線菌科Thermoactinomycetaceae，革蘭氏陽性好氧菌，該屬菌株最適生長溫度35～65℃[25]，在蘑菇渣堆肥、干草堆、土壤和水體中廣泛分布[26-27]。嗜熱真菌屬Thermomyces 相對豐度與木聚糖酶活性顯著正相關(guān)（表3），同時，Thermomyces lanuginosus 被證明因能產(chǎn)生多種耐熱半纖維素酶而在多種物料的堆肥發(fā)酵過程中大量出現(xiàn)[7]。以上結(jié)果說明，嗜熱裂孢菌屬Thermobifida、糖單孢菌屬Saccharomonospora、清野氏菌Planifilum 和嗜熱真菌屬Thermomyces 是主要的半纖維素降解者。

鑒定到參與蛋白質(zhì)降解的功能菌主要為糖單孢菌屬Saccharomonospora 和海源菌屬Idiomarina。糖單孢菌屬Saccharomonospora 最早分離自蘑菇渣堆肥中，其胞外蛋白酶多耐熱（如最適溫度60 ℃）且偏堿性（如最適pH 8.0）[28]。在本研究結(jié)果中，源于Saccharomonospora 的蛋白酶主要有兩類：絲氨酸蛋白酶（C7MXV7、A0A1V9AC37）和胰蛋白酶（C7MV18、C7MTG2）。這些都是典型的堿性蛋白酶。除此之外，還鑒定到一種源于海源菌屬Idiomarina的絲氨酸內(nèi)切蛋白酶（A0A094IT45）。該蛋白酶的鑒定、Idiomarina 的相對豐度與蛋白酶活性間的顯著正相關(guān)性結(jié)果（表3）表明，海源菌屬Idiomarina 在堆肥發(fā)酵蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮重要作用。

圖3 不同時期所取堆肥樣品在細(xì)菌（a）和真菌（b）屬層次上的組成Fig.3 Genera of bacteria （a） and fungi （b） in samples collected at different times

表2 第3 周堆肥樣品中主要細(xì)菌屬和真菌屬分泌蛋白的功能鑒定Table 2 Functions of enzymes secreted by dominant bacterial and fungal genera in samples taken in 3rd week

續(xù)上表

表3 主要微生物屬和酶活性的相關(guān)性Table 3 Correlations between dominant genera and enzyme activities

3 討論與結(jié)論

本研究利用整合宏組學(xué)技術(shù)研究了番茄秸稈與玉米秸稈共堆肥生境中的關(guān)鍵微生物及其功能，從基因豐度上看，主要細(xì)菌門為放線菌門Actinobacteria（23.1%）、變形菌門Proteobacteria（37.3%）和厚壁菌門Firmicutes（26.5%），主要細(xì)菌屬為嗜熱裂孢菌屬Thermobifida（16.5%）、海源菌屬Idiomarina（15.6%）、芽孢桿菌Bacillus（4.2%）、黃桿菌屬Flavobacterium（2.4%）、熱 桿 菌 屬Thermobacillus（1.9%）、 糖 單 孢 菌 屬Saccharomonospora（1.4%）和清野氏菌Planifilum（1.2%）；主要真菌門為子囊菌門Ascomycota（81.3%），代表屬為嗜熱真菌屬Thermomyces（70.5%）。嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 功能多樣，既通過產(chǎn)生GH5、GH9 家族的內(nèi)切纖維素酶，GH6、GH48 家族的纖維二糖水解酶參與纖維素的降解；又通過分泌GH10 家族的β-木聚糖酶參與半纖維素的降解；同時參與果膠裂解。糖單孢菌屬Saccharomonospora 主要參與蛋白質(zhì)的降解，分泌多種絲氨酸蛋白酶和胰酶，同時通過產(chǎn)生GH10 家族的β-木聚糖酶，參與木聚糖的降解。其他功能菌還有，清野氏菌Planifilum 和嗜熱真菌屬Thermomyces 分別通過產(chǎn)生GH10 和GH11 家族的內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶參與半纖維素的降解，海源菌屬Idiomarina 通過分泌絲氨酸蛋白酶參與蛋白質(zhì)的降解。

在本研究中，嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 是唯一的纖維素降解者，這與Anbarasan 等[29]的研究結(jié)果基本一致，認(rèn)為嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 因能產(chǎn)生多種纖維素酶和半纖維素酶，是秸稈類堆肥物料的主要降解者。除嗜熱裂孢菌屬Thermobifida 外，糖單孢菌屬Saccharomonospora、清野氏菌Planifilum 和嗜熱真菌屬Thermomyces 共同參與番茄秸稈半纖維素的降解，而Zhang 等[7]關(guān)于玉米秸稈條垛式堆肥的研 究 發(fā) 現(xiàn)，Thermomyces lanuginosus、Aspergillus 和Thermopolyspora 是半纖維素的主要降解者。這種功能微生物的差異可能因堆肥物料的組成和性質(zhì)、環(huán)境因子，如溫度、濕度、供氧量和C/N 等因素有關(guān)[30]。

同時，Liu 等[6]利用DGGE 技術(shù)研究了生物炭、泥煤沼和沸石等調(diào)理劑對番茄秸稈堆肥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明黃桿菌屬Flavobacterium對應(yīng)條帶較明顯，且廣泛存在于堆肥發(fā)酵各階段。在本研究結(jié)果中，黃桿菌屬Flavobacterium 同樣具有相對較高的豐度（2.4%），但質(zhì)譜檢測時并未檢出源于該菌的蛋白。由于DGGE 指紋圖譜技術(shù)和高通量焦磷酸測序技術(shù)均是基于DNA 的序列差異對微生物的群落結(jié)構(gòu)進行表征。在樣品總DNA 的提取過程中，無論是有生命的還是已經(jīng)死亡的生物體DNA 均會被提取出來。例如，據(jù)估算，土壤總DNA 的40%源于已經(jīng)死亡或不完整的生物體[31]。因此，僅通過分子生物學(xué)手段或高通量焦磷酸測序，以基因豐度來表征微生物的重要程度是有挑戰(zhàn)性的[32]。

基于蛋白質(zhì)水平的檢測技術(shù)（如質(zhì)譜等）僅對活的細(xì)胞及其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進行分析，其表征的功能微生物群落結(jié)構(gòu)肯定會與基于DNA 水平（如DGGE、高通量測序等）的微生物群落結(jié)構(gòu)有所差異。如在本研究中，F(xiàn)lavobacterium 的基因豐度雖占細(xì)菌全部序列的2.4%，但卻沒有檢測到對應(yīng)的胞外蛋白。因此，只有將高通量焦磷酸測序和宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法聯(lián)合起來，形成“整合宏組學(xué)方法”，才能更好地將微生物的群落結(jié)構(gòu)及其參與的生態(tài)過程聯(lián)系起來。

此外，本文僅檢測了植物生物質(zhì)和蛋白質(zhì)降解最旺盛時期（第3 周）的微生物群落組成及關(guān)鍵微生物的功能。整個發(fā)酵周期內(nèi)主要微生物的群落演替及其功能變化需要進一步深入研究[33]。