何深宏，程方俊，羅 干，張 耕，杜亞楠，康霞梅，王曉涵，趙自亮，任紹科，郭建華

（西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460）

0 引言

【研究意義】隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)迅速發(fā)展，傳統(tǒng)分散式養(yǎng)殖模式正逐漸被集約化養(yǎng)殖模式所代替。集約化養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的大量糞污對(duì)環(huán)境造成了巨大危害，并且隨著我國(guó)環(huán)境保護(hù)力度的不斷加大，牛糞的無(wú)害化處理已成為限制我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要因素[1]。牛糞由于纖維素、木質(zhì)素等難降解物質(zhì)含量高、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)等原因，導(dǎo)致其開(kāi)發(fā)利用受到嚴(yán)重制約[2-3]。目前，我國(guó)牛糞無(wú)害化處理的主要方法包括生態(tài)還田法、沼氣發(fā)酵法、堆肥化技術(shù)、墊料回用模式等，但由于土地資源、經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和安全性等因素，生態(tài)還田、沼氣發(fā)酵、墊料回用模式等方法未能得到廣泛應(yīng)用[4]。近年來(lái)，堆肥化技術(shù)因其成本投入較低、肥效較高、安全、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為人們無(wú)害化處理牛糞的首要選擇?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】堆肥化技術(shù)的主要原理是利用高產(chǎn)纖維素酶微生物對(duì)牛糞中纖維素的降解作用[5]。有關(guān)研究表明，從環(huán)境中分離得到的降解纖維素的微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌，其中真菌的降解能力較強(qiáng)，以木霉菌[6]和曲霉菌[7]產(chǎn)生和分泌的纖維素酶系最全面，效果也最佳。細(xì)菌降解纖維素的能力與真菌相比雖然稍遜一籌，但其具有繁殖速度快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短等特點(diǎn)。劉宇等[8]從玉米青貯飼料樣品中篩選獲得一株具有一定產(chǎn)纖維素酶能力的解淀粉芽孢桿菌。崔海洋等[9]從土壤中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，其羧甲基纖維素酶最高可達(dá)307.23 U·mL-1。劉鎖珠等[10]從藏豬糞便中分離得到一株可高效降解纖維素的解淀粉芽孢桿菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】堆肥牛糞中具有較多能夠降解纖維素的細(xì)菌，從牛糞堆肥樣品中分離篩選纖維素酶活性高、繁殖速度快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單的降解纖維素優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以重慶三峽庫(kù)區(qū)3 個(gè)牛糞堆肥廠的牛糞為研究對(duì)象，采用10 倍稀釋法和平板劃線相結(jié)合的方式分離純化微生物，利用水解圈法作為初篩和羧甲基纖維素（Carboxymethyl cellulose, CMC）酶糖化力法作為復(fù)篩，以分離篩選出適合該地區(qū)地理氣候條件的高效分解牛糞中纖維素的微生物，并且通過(guò)菌株形態(tài)特征觀察、生理生化和分子生物學(xué)方法鑒定其種屬，為重慶三峽庫(kù)區(qū)牛糞的快速無(wú)害化降解提供優(yōu)勢(shì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 采用五點(diǎn)采樣法分別從重慶三峽庫(kù)區(qū)3 個(gè)牛糞堆肥廠采集發(fā)酵第5 d、第15 d、第25 d、第35 d、第45 d 牛糞樣品，放入冰盒后立即送回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鈉1.2 g，磷酸二氫鉀0.9 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，酵母浸出粉0.5 g，酸水解酪蛋白0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.1[11]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，氯化鈉5.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.1[11]。

1.1.3 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)于大連寶生物有限公司；細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司；瓊脂糖購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；LB 培養(yǎng)基購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化 稱取1 g 樣品懸浮于99 mL 無(wú)菌蒸餾水中，充分混合均勻。采用10 倍稀釋法將樣品稀釋成10-4、10-5、10-6等3 個(gè)濃度梯度，吸取各濃度梯度稀釋液200 μL 分別涂布于CMC 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至得到純培養(yǎng)物。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩 參照文獻(xiàn)[12]，采用水解圈法進(jìn)行初篩。將純培養(yǎng)物37 ℃、160 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)16 h 并通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岱▽⒓兣囵B(yǎng)物混懸液稀釋到0.5 個(gè)麥?zhǔn)蠞舛群螅?0 μL 純培養(yǎng)物混懸液點(diǎn)種于CMC 培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)4 d 后，采用0.2%剛果紅染色30 min，用蒸餾水和生理鹽水洗凈染液，再用5%的醋酸固定顏色。每種純培養(yǎng)物進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量純培養(yǎng)物菌落直徑（d）與水解圈直徑（D），根據(jù)水解圈直徑和純培養(yǎng)物菌落直徑比值（D/d）篩選出比值大的純培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 菌株16S rRNA 基因鑒定 以復(fù)篩所得純培養(yǎng)物DNA 為模板，16S rRNA 基因通用引物（購(gòu)于武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：上下游引物各2 μL（0.5 μmol·L-1）、模板DNA 1 μL（100 ng）、ddH2O 20 μL、2×Premix Taq 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物切膠回收送重慶擎科生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)軟件MEGA6.0 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.4 菌株復(fù)篩 參考DB33/T459-2003 標(biāo)準(zhǔn)，采用CMC 酶糖化力法進(jìn)行測(cè)定。將純培養(yǎng)物接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h 后，按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后菌液置于4 ℃、4 000 r·min-1離心20 min，取上清液（即待測(cè)粗酶液）。

取4 支刻度試管（1 支為空白管，3 支為樣品管），分別向4 支試管中準(zhǔn)確加入0.5 mL 待測(cè)粗酶液（空白管加入粗酶液后沸水浴10 min）。向待測(cè)粗酶液樣品管中加入1% CMC 溶液1.5 mL 和向空白管中加入3, 5-二硝基水楊酸（DNS）試劑3 mL，（40±0.2）℃準(zhǔn)確水浴反應(yīng)10 min 后取出，迅速向待測(cè)樣品管中加入DNS 試劑3 mL、空白管中加入1% CMC溶液1.5 mL，混勻。沸水浴反應(yīng)5 min，取出流水迅速冷卻至室溫后，向各試管中加入10 mL 蒸餾水，混勻。以空白管調(diào)分光光度計(jì)零點(diǎn)，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定各待測(cè)樣品酶液吸光度，計(jì)算酶活。纖維素酶活力定義為在1 min 內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg 葡萄糖的酶量即為1 個(gè)酶活力單位，每個(gè)樣品做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定 菌體形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行鑒定。無(wú)菌條件下將復(fù)篩所得純培養(yǎng)物接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色并且將純培養(yǎng)物接種于生化反應(yīng)管中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察記錄結(jié)果。

1.2.6 菌株多重PCR 鑒定 參考Cao F M[15]種特異性引物（由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，具體引物序列見(jiàn)表1）。多重PCR 反應(yīng)體系為：引物BSL72、BSR328、L100、R836、L168、R514、R 674 各0.8 μL（0.5 μmol·L-1）、引物L(fēng)354 為1.2 μL（0.5 μmol·L-1）、模 板DNA 1 μL（100 ng）、ddH2O 2.2 μL、2×Premix Taq 10 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，61.7 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[15]。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 種特異性引物Table 1 Species specific primers

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離純化與初篩結(jié)果

采用10 倍梯度稀釋法與平板劃線相結(jié)合，共分離純化得到57 株純培養(yǎng)物。通過(guò)點(diǎn)種于CMC 培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行剛果紅染色、醋酸固定后測(cè)量水解圈直徑（D）與純培養(yǎng)物菌落直徑（d），共篩選出10株水解圈直徑與菌落直徑比值大于3 的菌株（表2）。水解圈直徑與菌落直徑的比值越大，表明菌株產(chǎn)纖維素酶能力越強(qiáng)，降解纖維素能力越強(qiáng)[16]。

表2 水解圈直徑與菌落直徑Table 2 Hydrolysis circle and colony diameter tests

2.2 菌株16S rRNA 基因鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

分別提取初篩所得10 株菌株DNA 進(jìn)行16S rRNA基因PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得10 條約1 500 bp 目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。將測(cè)序所得序列分別在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示菌株LP5 與賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）16S rRNA 基因序列相似性最高，為99.86%，其屬于賴氨酸芽孢桿菌屬；其余9 株菌株與已知芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）16S rRNA 基因序列相似性均在98%以上，為芽孢桿菌屬，其中菌株X10 的16S rRNA 基因序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，MH934926.1）的相似性最高，相似性高達(dá)99.93%。

采用Neighbor-Joining（NJ）法，利用生物信息學(xué)軟件MEGA6.0 對(duì)10 株菌株16S rRNA 基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖1?；?6S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，菌株X10 與解淀粉芽孢桿菌（KF689544.1、JX907998.1、MH934926.1 等）位于同一簇內(nèi)，相似性最高。

圖1 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.3 初篩所得10 株菌株的復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的10 株菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果顯示，菌株X10 的CMC 酶活力最高，為31.9 U·mL-1（表3）。

2.4 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 形態(tài)學(xué)觀察及水解圈結(jié)果

高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)24 h 后，形成白色、凸起、表面褶皺無(wú)光澤、濕潤(rùn)、黏稠、不透明、直徑3～4 mm 圓形的菌落（圖2）；革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈短桿狀，芽孢中生或端生、孢囊不膨大（圖3）；菌株X10 水解圈見(jiàn)圖4。

2.5 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 生化鑒定結(jié)果

高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 生化試驗(yàn)結(jié)果由表4 可知，高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 七葉苷、VP 試驗(yàn)、水楊酸試驗(yàn)為陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、甘露醇、MR（甲基紅）、硫化氫、靛基質(zhì)試驗(yàn)為陰性，符合解淀粉芽孢桿菌生理生化特性[13-14]。

表3 CMC 酶活測(cè)定結(jié)果Table 3 CMC enzyme activity assay results

圖2 菌株X10 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性Fig.2 Growth of strain X10 on general nutrient agar medium

圖3 菌株X10 革蘭氏染色（10×100 倍）Fig.3 Gram stained strain X10（10×100 times）

圖4 菌株X10 纖維素酶水解圈Fig.4 Cellulase hydrolysis circle by strain X10

2.6 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 多重PCR 擴(kuò)增結(jié)果

提取菌株X10 基因組進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得大小約736 bp 目的條帶，目的條帶基因片段大小與預(yù)期片段大小一致（圖5）。

表4 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 生化鑒定結(jié)果Table 4 Biochemical identification of cellulase-producing strain X10

圖5 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 多重PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Multiplex PCR amplifications of cellulase-producing strain X10

3 討論

牛糞發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌株具有一定的地理氣候差異性。本研究從重慶三峽庫(kù)區(qū)3 個(gè)牛糞堆肥廠樣品中共分離得到57 株細(xì)菌，其中菌株X10 纖維素酶活最高，達(dá)31.9 U·mL-1。通過(guò)菌株形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA 基因鑒定，確定菌株X10 為芽孢桿菌屬細(xì)菌，革蘭氏染色陽(yáng)性。由于16S rRNA 基因鑒定方法只能確定到該菌所在的屬，無(wú)法精確到該菌的種。本研究利用Cao F M[15]學(xué)者于2008年建立的用于快速鑒定解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的多重PCR 方法對(duì)分離菌株X10 進(jìn)行多重PCR 鑒定，最終確定菌株X10 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶能夠切割纖維素中β-1,4 糖苷鍵并且具有碳水化合物的結(jié)合位點(diǎn)，因此被認(rèn)為是主要的纖維素酶[17]。近些年來(lái)對(duì)產(chǎn)纖維素酶微生物的研究報(bào)道越來(lái)越多。楊麗娜等[18]從腐爛秸稈和腐木分離篩選得到一株產(chǎn)耐熱性纖維素酶菌株NP29，其纖維素酶活為1.8 U·mL-1。姜軍坡等[19]以CMC 酶活力為指標(biāo)，對(duì)解淀粉芽孢桿菌Tu-ll5 菌株產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，酶活力達(dá)到（18.43±0.91）U·mL-1，比優(yōu)化前提高了26.5 倍。黃玉蘭等[20]從若爾蓋高寒濕地土壤中篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株XW-1，CMC 酶活達(dá)到15.6 U·mL-1。王凱等[21]從140 株芽胞桿菌中篩選出一株具有較高纖維素酶活力的解淀粉芽胞桿菌FJAT-8 754，該菌株初始的纖維素酶活力為15.69 U·mL-1，經(jīng)均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化后纖維素酶活力高達(dá)202.9 U·mL-1。本研究通過(guò)水解圈法和CMC 酶糖化力法對(duì)分離菌株進(jìn)行纖維素酶活性初篩和復(fù)篩，最終獲得一株CMC 酶活達(dá)31.9 U·mL-1的解淀粉芽孢桿菌X10，與上述學(xué)者分離所得的產(chǎn)纖維素酶菌株相比處于較高水平，其具有較好的產(chǎn)纖維素酶菌株初始條件，有望在纖維素酶活力優(yōu)化的進(jìn)一步研究中發(fā)揮積極作用。

不同地理氣候特征和來(lái)源的產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌具有一定差異性。重慶三峽庫(kù)區(qū)屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，并具有河谷氣候特點(diǎn)為夏季高溫、降水充沛，與長(zhǎng)江以南同緯度或緯度偏低的臨近地區(qū)相比，具有明顯的熱量?jī)?yōu)勢(shì)[22]。本研究從重慶三峽庫(kù)區(qū)3 個(gè)牛糞堆肥發(fā)酵場(chǎng)不同發(fā)酵時(shí)期的樣品中共分離得到57 株細(xì)菌，并篩選出1 株纖維素酶活力較高的解淀粉芽孢桿菌X10。解淀粉芽孢桿菌X10 在重慶三峽庫(kù)區(qū)高效降解纖維素菌劑的研發(fā)方面具有積極作用，同時(shí)有望為該地區(qū)牛糞的快速無(wú)害化降解提供優(yōu)勢(shì)菌種資源。