◎ 莫秋云，陶劍恒，唐昭領

（賀州市檢驗檢測中心，廣西 賀州 542800）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，是一種潛在致癌性霉菌毒素，是禾谷鐮刀菌侵染谷物時產(chǎn)生的B 型單端孢霉烯族毒素[1-2]。DON 在250 ℃下1 h 以上才能被完全降解[3]。谷類作物在生長、收割、倉儲、加工、運輸和銷售等諸多環(huán)節(jié)均可能產(chǎn)生霉變，因此DON 廣泛存在于受霉菌污染的小麥、大麥、玉米及其加工產(chǎn)品中[4]。DON 可抑制真核生物細胞蛋白質(zhì)合成，破壞人和動物的免疫系統(tǒng)，既能引起急性中毒，也可造成慢性損害。動物急性中毒主要表現(xiàn)為嘔吐、拒食、體質(zhì)量降低和腹瀉，人群DON 急性中毒癥狀包括惡心、嘔吐、胃腸紊亂、頭暈、頭痛和腹瀉，慢性中毒表現(xiàn)為攝食減少、生長緩慢及血清免疫球蛋白水平改變[5-8]。

小麥是全球種植面積最大、總產(chǎn)量最高，也是最為重要的糧食作物，全球有超過1/3 的人口以小麥制品為主食。在中國，小麥僅次于第一大糧食作物水稻，小麥及其制品的質(zhì)量安全直接關系到中國過半人口的食品安全[9]。我國在《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中明確規(guī)定小麥粉中DON 的限量為1 000 μg·kg-1，DON 是糧食檢測中十分重要的安全指標[10]。

國家標準中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法主要有4種，同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜測定法以及酶聯(lián)免疫吸附篩查法，適用于小麥粉中DON 的測定主要為免疫親和層析凈化高效液相色譜法[11]。劉霞[12]對《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》（GB 5009.111—2016）中高效液相色譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行了驗證，其測試的色譜條件為流動相甲醇-水（20 ∶80，V/V），流速1 mL·min-1，檢測波長218 nm，線性和回收較好。姜云晶等[13]對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行了含量檢測，色譜條件為流動相為乙腈-水（16 ∶84，V/V）；流 速0.8 mL·min-1；紫 外 波 長 218 nm。姚霞等[14]比較了免疫親和柱-高效液相色譜法和免疫親和柱-液質(zhì)聯(lián)用法檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高，檢出限低，但在檢測有本底樣品時容易產(chǎn)生假陽性，成本高，高效液相色譜法更簡便、經(jīng)濟、環(huán)保。免疫親和高效液相色譜法結合二極管陣列器定性和定量檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的文獻報道較少，何攀等[15]優(yōu)化了液相色譜條件為流動相為甲醇-水（25 ∶75，V/V），檢測波長240 nm、掃描范圍190 ～400 nm，研究了定性分析的方法。本文在國家標準方法的基礎上，選用特異的嘔吐毒素免疫親和柱凈化，高效液相色譜結合二極管陣列檢測器測定小麥粉中的DON。本方法前處理簡單快速，高回收高靈敏，結合二極管陣列檢測器，通過保留時間和光譜掃描定性可實現(xiàn)樣品確證。該方法避免了現(xiàn)有標準方法的假陽性，對提高檢測分析效率和保障糧食安全有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥粉，市場購買。

1.2 試劑與儀器

甲醇（色譜純），F(xiàn)isher 公司；聚乙二醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和鹽酸（分析純），國藥集團；實驗室用水為Milli-Q 超純水；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品（濃度為200 mg·L-1，標準證書編號為CDAA-S-290023-AB-1 mL），購于上海安譜實驗科技股份有限公司（ANPEL）。

1260 液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器），美國安捷倫公司；BT125D 電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；HM100 刀式研磨儀，北京格瑞德曼儀器有限公司；JJSJ22 圓孔篩，飛穗；S180H 超聲波清洗器，德國ELMA；HNDK200-2 氮氣吹掃儀，東京理化器械株式會社；ST16R 高速冷凍離心機，賽默飛世爾；移液槍（20 ～200 μL，100 ～1 000 μL），德國艾本德股份有限公司；玻璃纖維濾紙，孔徑1.5 μm；0.22 μm水相微孔濾膜；50 mL 聚丙烯具塞刻度離心管；10 mL一次性注射器；真空泵；嘔吐毒素免疫親和柱（3 mL，1 000 ng），美國Romer。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

（1）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液配制。準確移取適量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液（200 μg·mL-1），用初始流動相稀釋，配制成100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、750 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的標準系列工作液。

（2）磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱PBS）配制。稱取8.00 g 氯化鈉、1.20 g 磷酸氫二鈉、0.20 g 磷酸二氫鉀、0.20 g 氯化鉀，用900 mL 水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.0，用水定容至1 000 mL。

（3）甲醇-水溶液（25+75）配制。量取250 mL甲醇加入到750 mL 水中，混勻。

1.3.2 樣品前處理

①采樣和試樣制備。抽取有代表性的樣品，用四分法縮減取1 000 g，粉碎后過0.5 mm 孔徑的分析篩，混勻，裝入自封袋中，密封保存，備用。②提取。稱取25 g（準確到0.1g）試樣于100 mL 具塞三角瓶中，加入5 g 聚乙二醇，加水100 mL，混勻，置于超聲波振蕩器超聲20 min，以玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液，在10 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。③凈化。事先將低溫下保存的嘔吐毒素免疫親和柱恢復至室溫。待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準確移取 2.0 mL 上清液，注入注射器中。將真空泵與注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1 滴的流速通過免疫親和柱，用5 mL PBS 緩沖鹽溶液和5 mL 水先后淋洗，流速約為每秒1 ～2 滴，棄去全部流出液，抽干小柱。④洗脫。準確加入2 mL 甲醇洗脫親和柱，控制每秒1 滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入 1.0 mL 初始流動相，渦旋30 s 溶解殘留物，過0.22 μm濾膜以備檢測。

1.3.3 液相色譜條件

安捷倫Pursuit C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm，SN：552685）；流動相：甲醇+水（25+75）；流速：0.8 mL·min-1；進樣體積：50 μL；柱溫：35 ℃；檢測波 長：218 nm；光譜掃描范圍：210 ～400 nm。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動相比例優(yōu)化

試驗分別配制甲醇-水（V∶V）10 ∶90、15 ∶85、 20 ∶80、25 ∶75 和30 ∶70，在280 nm，0.8 mL·min-1流速下對DON 標準溶液進行測定分析。結果表明，隨著流動相甲醇（有機相）比率的增大，DON 出峰越快，保留時間越短，但分離度也隨之變化。出峰越早，越容易被雜質(zhì)峰（洗脫液）包裹。在甲醇-水為25 ∶75（V∶V）時，保留時間為4.3 min，分離度最好，一次進樣在8 min 內(nèi)完成。

2.1.2 流動相流速優(yōu)化

流動相的流速是另一個影響色譜出峰的重要因素。在其他條件不變的情況下，試驗分別在流速為 0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1條件下進行DON 標準物質(zhì)測定。結果表明，流速越低，分離度越好，但DON 出峰慢，日常大批量檢測成本高。在流速0.8 mL·min-1時，出峰時間和分離度最優(yōu)。優(yōu)化色譜條件后，DON 標準溶液色譜圖見圖1。

圖1 DON 標準色譜圖

2.2 前處理條件優(yōu)化

樣品經(jīng)過優(yōu)化的提取條件提取后，選用特異的嘔吐毒素免疫親和柱對目標物進行凈化，洗脫更完全，柱回收率更高。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

試 驗 以 流 動 相 配 制100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、750 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的DON 標準系列工作液進行測定分析，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣標準溶液濃度（ng·mL-1）為橫坐標（X），繪制回歸方程為Y=0.231 753X-6.231 59，線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 70，結果如圖2 所示。取未被DON污染的小麥粉樣品，以信噪比為3（S/N=3）的標準溶液濃度加標，計算檢出限為36 μg·kg-1。

圖2 回歸曲線圖

2.4 回收率及精密度試驗

以未被DON 污染的小麥粉為樣品，在200 μg·kg-1、400 μg·kg-1和1 000 μg·kg-13 個水平下進行加標回收試驗，每個加標樣平行測試6 次，計算回收率和精密度。由表1 可知，樣品加標回收率在91.2%～98.0%，精密度為0.73%～3.19%，回收率較高，偏差較小。

表1 不同加標水平回收率和精密度表

2.5 二極管陣列檢測器定性

通過二極管陣列檢測器對DON 標準溶液進行光譜掃描，掃描范圍（210 ～400 nm），DON 最大吸收波長為218 nm，與光譜圖庫進行比對，特征顯著 （圖3），通過保留時間和光譜圖可以對DON 實現(xiàn)定性分析，實現(xiàn)樣品確證。

圖3 光譜圖庫和標準溶液DON 光譜對比圖

2.6 實際樣品測定

用本方法對市售的10 份小麥粉樣品進行檢測，沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結論

本試驗建立了基于特異嘔吐毒素免疫親和柱，高效液液相色譜結合二極管陣列檢測器測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，在國家標準方法基礎上，實現(xiàn)了簡化前處理操作、提高方法回收率及靈敏度和檢測結果定性定量準確性、無需質(zhì)譜進行確證等目的。該方法的建立是現(xiàn)有標準的極大改進，對政府部門開展相關產(chǎn)品的風險監(jiān)測和檢測部門開展相應的常規(guī)分析檢測具有重要的參考依據(jù)。