梁金花 郭行端 梁金玲 劉裕曉 黃蕙莉 黃敏

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高，物質(zhì)資源的豐富，高脂飲食十分常見，研究表明，長期的高脂飲食能夠增加胰島素抵抗的發(fā)生，高脂飲食是誘發(fā)胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素之一[1]。故研究高脂飲食誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗的分子機(jī)制，對(duì)尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)有著不可忽視的重要性。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是表達(dá)于各種組織的絲/蘇氨酸激酶，GSK-3具有多種功能，與細(xì)胞內(nèi)糖原代謝，胰島素信號(hào)途徑，細(xì)胞增殖等都有密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，作為GSK-3家族成員之一的GSK-3β是肝糖代謝的關(guān)鍵酶，在胰島素信號(hào)通路中，胰島素抑制GSK-3β的活性，參與肝糖原的合成代謝[2-3]。胰島素信號(hào)通路障礙是產(chǎn)生胰島素抵抗和高血糖癥的主要機(jī)制，然而GSK-3β在高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗中的作用機(jī)制尚未明確。本研究構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型，將GSK-3β列為靶向基因，研究其在高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型中的作用機(jī)制，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

雄性C57BL/6J小鼠共60只（均購自上海吉?jiǎng)P基因公司，8周齡，體重為15～18 g，其中20只為GSK-3β基因敲除小鼠，另40只為普通小鼠），基因鑒定合格的小鼠納入研究，排除鑒定失敗的小鼠，同樣的條件進(jìn)行正常飼養(yǎng)[（22±2）℃、40%～60%濕度、12 h晝夜循環(huán)）]，高脂飲食所用飼料購自廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

同樣的條件進(jìn)行正常飼養(yǎng)[（22±2）℃、40%～60%濕度、12 h晝夜循環(huán)）]，待小鼠12周后，從40只普通小鼠中隨機(jī)取20只進(jìn)行GSK-3β慢病毒過表達(dá)轉(zhuǎn)染（慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因公司），60只小鼠再正常飼養(yǎng)12周后，從普通小鼠（共20只）、GSK-3β基因敲除小鼠（共20只）、GSK-3β慢病毒過表達(dá)小鼠（共20只）這三組中各隨機(jī)選擇10只小鼠進(jìn)行高脂飲食飼養(yǎng)16周，余下的小鼠均為普通飲食飼養(yǎng)，由此分成普通飲食組 [普通小鼠 1（control 1）、GSK-3β 基因敲除小鼠1（GSK-3β-1）、GSK-3β慢病毒過表達(dá)小鼠1（GSK-3β+1）]和高脂飲食組[普通小鼠2（control 2）、GSK-3β 基因敲除小鼠 2（GSK-3β-2）、GSK-3β慢病毒過表達(dá)小鼠2（GSK-3β+2）]，共六組（每組10只）。喂養(yǎng)過程均無小鼠死亡。在高脂飲食的第12周（飼養(yǎng)第36周），進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)（GTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）。在高脂飲食的第16周（飼養(yǎng)第40周），進(jìn)行空腹血糖及胰島素的檢測(cè)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。在高脂飲食的第16周（飼養(yǎng)第40周），進(jìn)行骨骼肌及肝臟的取材，進(jìn)行油紅染色；提取組織蛋白，進(jìn)行免疫印跡（WB）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)骨骼肌及肝臟組織中GSK-3β及蛋白激酶（AKT）、磷酸化蛋白激酶（p-AKT）的表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 葡萄糖耐量試驗(yàn)（glucose tolerance test，GTT） 高脂飲食的第12周的第1天16：00點(diǎn)開始禁食，六組小鼠空腹過夜16 h，第2天8：00點(diǎn)開始注射葡萄糖，根據(jù)小鼠體質(zhì)量以2 mg/g體重注射葡萄糖，在靜脈注射葡萄糖的不同時(shí)間點(diǎn)（注射前及注射30、60、120 min）從尾靜脈分別收集小鼠的血標(biāo)本，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各組小鼠血糖并記錄。

1.3.2 胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT） 高脂飲食的第12周（飼養(yǎng)第36周）的第4天22：00點(diǎn)開始禁食，六組小鼠空腹過夜8 h，第2天6：00點(diǎn)開始注射胰島素，根據(jù)小鼠體重以0.75 mU/g注射普通胰島素，在靜脈注射胰島素的不同時(shí)間點(diǎn)（注射前及注射30、60、120 min）從尾靜脈分別收集小鼠的血標(biāo)本，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各組小鼠血糖并記錄。

1.3.3 計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） 高脂飲食的第16周（飼養(yǎng)第40周）的第1天22：00點(diǎn)開始禁食，六組小鼠空腹過夜，第2天6：00點(diǎn)開始抽血標(biāo)本，提取空腹血標(biāo)本檢測(cè)血糖，用Elisa試劑盒檢測(cè)空腹胰島素，按公式計(jì)算HOMA-IR=空腹血糖水平（FPG，mmol/L）×空腹胰島素水平（FINS，mIU/L）/22.5；HOMA-IR＞2.7，為胰島素抵抗模型制作成功[4]。

1.3.4 油紅染色 六組小鼠在飼養(yǎng)第40周的第2天，全部進(jìn)行骨骼肌及肝臟的取材，進(jìn)行油紅染色，檢測(cè)其中脂肪沉積含量。準(zhǔn)備4 μm的標(biāo)本切片，雙蒸水洗滌后再用60%異丙醇洗滌，油紅染色1 h，然后準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精染色。

1.3.5 Western blot檢測(cè) 六組小鼠在飼養(yǎng)第40周的第2天，全部進(jìn)行骨骼肌及肝臟組織中蛋白的提取，檢測(cè)其中GSK-3β、p-AKT、AKT的表達(dá)。按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行組織蛋白質(zhì)的提取，濃度檢測(cè)，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、上機(jī)檢測(cè)，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，均經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)所得結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠葡萄糖耐量試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)血糖

葡萄糖耐量試驗(yàn)各組小鼠血糖水平隨時(shí)間呈先上升后下降的趨勢(shì)，多于30 min達(dá)到峰值。普通飲食組小鼠GSK-3β-1組及GSK-3β+1組同時(shí)間點(diǎn)血糖水平與control 1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高脂飲食組小鼠（control 2組、GSK-3β-2組、GSK-3β+2組）同時(shí)間點(diǎn)血糖均分別高于普通飲食組（control 1組、GSK-3β-1組、GSK-3β+1組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飲食組GSK-3β-2組小鼠同時(shí)間點(diǎn)血糖均低于control 2組，GSK-3β+2組同時(shí)間點(diǎn)血糖均高于control 2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖比較[mmol/L，（±s）]

表1 各組小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖比較[mmol/L，（±s）]

*與同時(shí)間點(diǎn)control 1組相比，P＞0.05；#與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β-1組相比，P＜0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β+1組相比，P＜0.05；▲與同時(shí)間點(diǎn) control 2 組相比，P＜0.05。

組別 注射前 注射30 min 注射60 min 注射120 min control 1 組（n=10） 4.12±0.56▲ 8.09±1.58▲ 7.15±1.36▲ 6.13±1.27▲GSK-3β-1組（n=10） 4.09±1.13* 7.92±1.09* 7.26±1.25* 6.34±1.17*GSK-3β+1組（n=10） 4.12±0.46* 8.22±0.71* 8.13±1.04* 7.03±1.10*control 2組（n=10） 5.82±0.56 13.39±1.65 12.15±1.78 9.13±2.27 GSK-3β-2組（n=10） 5.13±0.73#▲ 8.62±1.74#▲ 9.49±1.61#▲ 7.11±1.09#▲GSK-3β+2組（n=10） 6.69±1.16△▲ 19.63±2.28△▲ 18.10±1.94△▲ 10.12±1.38△▲

2.2 各組小鼠胰島素耐量試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)血糖

各組小鼠血糖隨時(shí)間呈先下降后上升的趨勢(shì)，普通飲食組小鼠GSK-3β-1組及GSK-3β+1組同時(shí)間點(diǎn)血糖水平與control 1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高脂飲食組小鼠（control 2 組、GSK-3β-2組、GSK-3β+2組）同時(shí)間點(diǎn)血糖均分別高于普通飲食組（control 1組、GSK-3β-1組、GSK-3β+1組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飲食組GSK-3β-2組小鼠同時(shí)間點(diǎn)血糖均低于control 2組，GSK-3β+2組同時(shí)間點(diǎn)血糖均高于control 2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠胰島素耐量試驗(yàn)血糖比較[mmol/L，（±s）]

表2 各組小鼠胰島素耐量試驗(yàn)血糖比較[mmol/L，（±s）]

*與同時(shí)間點(diǎn)control 1組相比，P＞0.05；#與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β-1組相比，P＜0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β+1組相比，P＜0.05；▲與同時(shí)間點(diǎn) control 2 組相比，P＜0.05。

組別 注射前 注射30 min 注射60 min 注射120 min control 1組（n=10） 4.12±0.27▲ 2.03±1.21▲ 2.35±1.34▲ 2.46±1.27▲GSK-3β-1 組（n=10） 4.03±0.42* 2.16±1.19* 2.26±1.15* 2.34±1.09*GSK-3β+1 組（n=10） 4.16±0.49* 2.32±0.91* 2.37±1.03* 2.39±1.12*control 2 組（n=10） 5.72±0.35 4.19±1.13 4.21±1.28 4.33±1.37 GSK-3β-2組（n=10） 5.22±0.55#▲ 3.02±1.01#▲ 3.11±1.24#▲ 3.30±1.13#▲GSK-3β+2組（n=10） 6.41±1.23△▲ 5.36±2.01△▲ 5.45±1.42△▲ 5.67±1.52△▲

2.3 各組小鼠FPG、FINS及HOMA-IR指數(shù)

普通飲食組小鼠GSK-3β-1組及GSK-3β+1組HOMA-IR指數(shù)同control 1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高脂飲食組小鼠（control 2組、GSK-3β-2組、GSK-3β+2組 ）HOMA-IR指數(shù)分別高于普通飲食組（control 1組、GSK-3β-1組、GSK-3β+1組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飲食組GSK-3β-2組小鼠HOMA-IR指數(shù)低于control 2組，GSK-3β+2組 HOMA-IR指數(shù)高于control 2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠FPG、FINS及HOMA-IR指數(shù)比較（±s）

表3 各組小鼠FPG、FINS及HOMA-IR指數(shù)比較（±s）

*與同時(shí)間點(diǎn)control 1組相比，P＞0.05；#與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β-1組相比，P＜0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β+1組相比，P＜0.05；▲與同時(shí)間點(diǎn) control 2 組相比，P＜0.05。

組別 FPG（mmol/L） FINS（mIU/L） HOMA-IR control 1組（n=10） 4.06±0.37 10.06±0.67 1.80±0.31▲GSK-3β-1組（n=10） 4.01±0.52 9.03±1.30 1.60±0.40*GSK-3β+1組（n=10） 4.13±0.39 10.01±0.94 1.90±0.40*control 2 組（n=10） 5.63±0.34 21.02±0.54 5.20±0.50 GSK-3β-2組（n=10） 5.03±0.65 15.01±0.48 3.40±0.60#▲GSK-3β+2組（n=10） 6.32±1.18 35.12±0.64 10.00±2.00△▲

2.4 各組小鼠脂肪沉積含量、GSK-3β、p-AKT及AKT的表達(dá)量

普通飲食組小鼠GSK-3β-1組及GSK-3β+1組脂肪沉積含量、p-AKT的表達(dá)量同control 1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高脂飲食組小鼠（control 2組、GSK-3β-2組、GSK-3β+2組）脂肪沉積含量均高于普通飲食組（control 1組、GSK-3β-1組、GSK-3β+1組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飲食組小鼠p-AKT的表達(dá)量分別低于普通飲食組（control 1組、GSK-3β-1組、GSK-3β+1組），GSK-3β-2組脂肪沉積含量低于control 2組，p-AKT的表達(dá)量高于control 2組，GSK-3β+2組脂肪沉積含量高于control 2組，p-AKT的表達(dá)量低于 control 2組（P＜0.05），而 AKT在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組小鼠脂肪沉積含量、GSK-3β、p-AKT及AKT的表達(dá)量比較（±s）

表4 各組小鼠脂肪沉積含量、GSK-3β、p-AKT及AKT的表達(dá)量比較（±s）

*與同時(shí)間點(diǎn)control 1組相比，P＞0.05；#與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β-1組相比，P＜0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β+1組相比，P＜0.05；▲與同時(shí)間點(diǎn) control 2 組相比，P＜0.05。

組別 脂肪沉積含量（g） GSK-3β（ng/ml） p-AKT AKT control 1 組（n=10） 2.01±0.57▲ 1.890±0.616 0.082±0.023▲ 0.033±0.005 GSK-3β-1組（n=10） 1.98±0.23* 0.000±0.000 0.089±0.021* 0.031±0.007 GSK-3β+1組（n=10） 2.32±0.61* 4.190±0.616 0.076±0.019* 0.029±0.006 control 2組（n=10） 6.01±0.57 7.270±0.792 0.041±0.016 0.032±0.007 GSK-3β-2 組（n=10） 4.98±0.23#▲ 0.000±0.000 0.054±0.015#▲ 0.031±0.005 GSK-3β+2 組（n=10） 8.93±0.14△▲ 11.260±0.561 0.012±0.003△▲ 0.029±0.008

3 討論

大量的流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示：長期高脂飲食的人群胰島素抵抗明顯高于正常人群[5]。胰島素抵抗，定義為胰島素敏感組織（骨骼肌、肝臟）對(duì)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、合成及抗脂質(zhì)分解等作用不敏感，血液中的胰島素水平可正?；蚋哂谡6-7]。胰島素抵抗與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其中包括2型糖尿病、高血壓、血脂異常、凝血和纖溶系統(tǒng)紊亂、非酒精性脂肪肝[8-10]。因此，研究高脂飲食引起胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

結(jié)果顯示，高脂飲食組較普通飲食小鼠葡萄糖耐量試驗(yàn)同時(shí)間點(diǎn)血糖高，HOMA-IR指數(shù)高，骨骼肌、肝臟脂肪沉積含量高（P＜0.05）。研究證實(shí)高脂飲食可誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，同正常飲食組相比，高脂組表現(xiàn)為高血糖、高血脂、高胰島素血癥，糖耐量減低，胰島素敏感性下降。高脂環(huán)境能損害骨骼肌、脂肪、肝臟在內(nèi)的多種外周胰島素靶腺器官對(duì)胰島素的敏感性，誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生[5]。骨骼肌是葡萄糖代謝的重要場(chǎng)所，它能夠與胰腺相互作用，共同調(diào)節(jié)胰島素的分泌并促進(jìn)外周細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的利用[11]。骨骼肌是糖代謝最重要的組織，被認(rèn)為是胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制中最主要的靶向目標(biāo)。胰島素刺激葡萄糖的利用，其中在骨骼肌組織中消耗的比例最大，因此，骨骼肌組織與胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12-13]。高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗均與骨骼肌組織相關(guān)，肝臟同樣是糖代謝的重要場(chǎng)所，包括肝糖原的合成和分解。當(dāng)攝入的熱量超過消耗的熱量，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積不僅發(fā)生在脂肪組織，而且可出現(xiàn)在一些異位組織，比如肝臟。肝臟過多的異位脂質(zhì)沉積能夠影響正常的細(xì)胞學(xué)功能，從而引起一些疾病的發(fā)生，包括脂肪肝、肝功能異常、胰島素抵抗等[14-15]。因此，肝臟同樣與高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，從分子水平可分為受體前、受體和受體后水平抵抗[16-17]。其中涉及多種因素和基因的相互作用、相互影響。胰島素信號(hào)通路障礙是產(chǎn)生胰島素抵抗和高血糖癥的主要機(jī)制。目前發(fā)現(xiàn)，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常主要發(fā)生在IRS家族、PI3K、蛋白激酶B、GSK-3及GLUT4水平[18-19]。GSK-3作為一種抑制糖原合成的限速酶為人們所熟知，參與多種信號(hào)的調(diào)控，其中包括胰島素細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以GSK-3β亞型的作用為主。近年來國內(nèi)外均有相關(guān)研究，提出GSK-3β的高表達(dá)與胰島素敏感性降低呈相關(guān)性。GSK-3β可以直接磷酸化糖原合成酶，當(dāng)體內(nèi)糖原合成酶成高表達(dá)時(shí)必然導(dǎo)致糖原合成酶的大量磷酸化，則抑制合成酶的功能，不能將體內(nèi)多余的葡萄糖有效地轉(zhuǎn)化為糖原儲(chǔ)存，最終導(dǎo)致血糖升高，胰島素抵抗。目前研究提示，AKT/GSK-3β信號(hào)通路在高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制中占有重要作用[20]。本研究將GSK-3β列為靶向基因，研究其在高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型中的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，高脂飲食組中GSK-3β慢病毒過表達(dá)小鼠較普通小鼠組葡萄糖耐量試驗(yàn)同時(shí)間點(diǎn)血糖高，HOMA-IR指數(shù)高，骨骼肌、肝臟脂肪沉積含量高，p-AKT的表達(dá)量低（P＜0.05）。高脂飲食組中GSK-3β基因敲除小鼠較普通小鼠對(duì)照組葡萄糖耐量試驗(yàn)同時(shí)間點(diǎn)血糖低，HOMA-IR指數(shù)低，骨骼肌、肝臟脂肪沉積含量低，p-AKT的表達(dá)量高（P＜0.05）。提示GSK-3β參與了高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的過程，GSK-3β的過度表達(dá)與高脂飲食胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，分子水平上抑制p-AKT的表達(dá)，抑制胰島素信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終促進(jìn)了胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過探討GSK-3β對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的作用機(jī)制，對(duì)于未來尋找2型糖尿病、血脂異常、非酒精性脂肪肝等由胰島素抵抗這種共同病理生理基礎(chǔ)的疾病的分子靶向治療提供了參考的價(jià)值。