李 方 侯 芳 齊長海 盧一艷 劉文婷 方 蘭 呂志勇 李珂敏

闌尾黏液性腫瘤(appendiceal mucinous neoplasms, AMNs)是一類罕見的異質(zhì)性闌尾腫瘤的總稱，其發(fā)病機制尚不清楚。AMNs膨脹性或侵襲性浸潤闌尾壁，導致黏液性腫瘤上皮及黏液播散至腹腔形成腹膜假黏液瘤(pseudomyxoma peritonei, PMP)。近年來分子病理學研究證實多種消化系統(tǒng)惡性腫瘤存在KRAS基因突變，使其治療進入了分子靶向治療的新時期。國外研究發(fā)現(xiàn)，AMNs存在KRAS基因的突變，但中國人AMNs是否存在KRAS基因突變還不清楚。本研究對AMNs組織采用實時熒光定量PCR法檢測KRAS基因的突變，揭示AMNs中KRAS基因突變類型及突變率，探討KRAS基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性，為其靶向治療提供潛在靶點提供理論依據(jù)。

對象與方法

1．研究對象：回顧性收集2019年6月～2021年9月在航天中心醫(yī)院進行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的AMNs標本62例，其中低級別闌尾黏液性腫瘤(low-grade appendiceal mucinous neoplasms, LAMN)36例，闌尾黏液腺癌(mucinous adenocarcinoma, MAC)26例。62例AMNs患者中有男性22例，女性40 例，男女性別比例為1∶1.82?；颊吣挲g29～79歲，中位年齡為59歲，年齡≤60歲的患者33例，年齡>60歲的患者29例。對入選的病例進行臨床病理資料的收集。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批。

2．診斷標準：按照2019年第5版世界衛(wèi)生組織(WHO)闌尾黏液性腫瘤的診斷標準及2017年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)腫瘤分期，由消化道腫瘤經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生對以下組織病理學參數(shù)進行評估[1，2]：闌尾原發(fā)性黏液性腫瘤的類型、繼發(fā)性PMP級別、脈管及神經(jīng)侵犯、腫瘤分級、病理分期。將AMNs分為LAMN G1和MAC G2，將AMNs繼發(fā)性PMP分為低級別PMP G1、高級別PMP G2和高級別PMP G3(高級別PMP伴有印戒細胞成分)，如果原發(fā)性AMNs與繼發(fā)性PMP級別不同的情況下，將綜合最高的級別確定為該病例的AJCC腫瘤分級：G1(LAMN或低級別PMP)、G2(MAC或高級別PMP G2)和G3(闌尾印戒細胞癌或高級別PMP G3)。

3．方法：選取每例中代表性區(qū)域的蠟塊，確保腫瘤細胞含量在30%以上，用無菌刀片切取5張10μm厚的連續(xù)石蠟切片，置于無菌的1.5ml離心管中。根據(jù)核酸提取試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)說明書步驟提取DNA，并用紫外分光光度計測量DNA濃度。按照人類KRAS基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)所示，采用探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)在熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)進行擴增。每批次檢測均設(shè)置陽性和陰性對照。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃ 5min；95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15個循環(huán)；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，31個循環(huán)。在第3階段60℃時收集信號，保存文件。根據(jù)各反應(yīng)擴增曲線判讀結(jié)果：以無模板對照擴增曲線的最高點為準設(shè)定閾值。結(jié)果判定：突變陰性：所有反應(yīng)管均沒出現(xiàn)擴增曲線或Ct 值≥陰性臨界Ct值；突變陽性：①出現(xiàn)擴增曲線且 Ct≤26；②26

4．統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。組間比較分析采用χ2檢驗、連續(xù)性校正χ2檢驗或Fisher精確檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1．臨床病理特征： 62例AMNs中LAMN G136例，MAC G226例。12例不伴有PMP，50例伴有PMP，其中29例伴有低級別PMP G1(其中3例伴有無細胞性黏液)，21例伴有高級別PMP(高級別PMP G2為15例，高級別PMP G3為6例)。AJCC腫瘤綜合分級中， G1為35例，G2為21例，G3為6例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的26例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的7例。無神經(jīng)侵犯的58例，有神經(jīng)侵犯的4例。無脈管侵犯的60例，有脈管侵犯的2例。AJCC病理分期中，0期5例，Ⅱ期6例(Ⅱa期4例，Ⅱc期2例)，Ⅲb期1例，Ⅳa期30例，Ⅳb期20例。AMNs及繼發(fā)性PMP病理形態(tài)學改變詳見圖1。

圖1 闌尾黏液性腫瘤及繼發(fā)性腹膜假黏液瘤的組織病理學改變A.低級別闌尾黏液性腫瘤G1；B.繼發(fā)性低級別腹膜假黏液瘤G1；C.闌尾黏液腺癌G2；D.繼發(fā)性高級別腹膜假黏液瘤伴印戒細胞成分G3 (A～C.HE，×100;D.HE，×200)

2.KRAS基因突變類型與突變率：在62例AMNs標本中，共檢出KRAS基因突變52例，突變率為83.9%。對KRAS 第2、3、4號外顯子均進行檢測，本組AMNs病例均為 KRAS的第2號外顯子突變，突變類型為12位密碼子G12D、G12A、G12V、G12S、G12C，以及13位密碼子G13D，其中G12D(35G>A)及G12V(35G>T)突變最為常見，分別占44.2%(23/52)及36.5%(19/52)。2例伴有12位密碼子2個位點的突變，包括G12D和G12S、G12V和G12C。KRAS第3、4外顯子均未檢測到突變。AMNs中KRAS基因突變類型詳見表1和圖2。

表1 闌尾黏液性腫瘤中KRAS基因突變類型與突變率

圖2 KRAS 基因突變類型及擴增曲線A.KRAS基因2號外顯子G12D突變；B.KRAS基因2號外顯子G12V突變

3.KRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系：62例AMNs中，LAMN中 KRAS 基因突變率為88.9%(32/36)，略高于MAC中KRAS 基因突變率 76.9%(20/26)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低級別PMP G1及高級別PMP G2中KRAS基因突變率分別為89.7%(26/29)和80.0%(12/15)，高于高級別PMP G3中KRAS基因突變率66.7%(4/6)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同樣，AJCC腫瘤級別G1的KRAS基因突變率為88.6%(31/35)，略高于G2(81.0%)及G3(66.7%)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，KRAS基因突變與性別、年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管侵犯、有無神經(jīng)侵犯及 AJCC病理分期均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。KRAS基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性詳見表2。

表2 闌尾黏液性腫瘤中KRAS基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

討 論

AMNs及繼發(fā)性PMP的發(fā)病機制尚不明確。KRAS基因位于12p12.1，是RAS基因家族的一個原癌基因，該家族還包含HRAS、NRAS等，其中KRAS基因與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切。KRAS基因編碼的K-ras蛋白是EGFR下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK, 即RAS/RAF/MEK/ERK)信號通路中一個起“開關(guān)”作用的關(guān)鍵分子。MAPK信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。當KRAS基因發(fā)生突變時，導致其不依賴上游的EGFR發(fā)生自身磷酸化而持續(xù)處于激活狀態(tài)。多種腫瘤存在KRAS基因突變，其中胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌最為常見，結(jié)直腸癌KRAS突變率為39.6%～41.3%[4～ 7]。

對于AMNs及PMP中KRAS基因的狀態(tài)，僅有少數(shù)國外研究報道了小樣本量病例的分子遺傳學改變。Zauber等[8]對31例LAMN的KRAS基因測序結(jié)果提示100%的病例出現(xiàn)突變，其中 G12D 和 G12V最為常見(各占42%)；并對照了正常闌尾42例，其KRAS基因均為野生型。Alakus 等[9]對10例闌尾源性PMP的全外顯子測序及19例PMP熱點基因測序結(jié)果提示KRAS突變率為89.6%。Noguchi 等[10]對18例PMP進行二代測序結(jié)果表明KARS突變率為77.8%。Zhu等[11]按照2017年AJCC闌尾腫瘤分級研究了21例LAMN G1、21例MAC G2及26例印戒細胞癌G3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其KRAS基因突變率分別為90%、86%、46%。本研究是對中國人AMNs中KRAS基因突變狀態(tài)的研究，與既往研究報道相似，中國人KRAS基因同樣存在高頻突變，突變率為83.9%，最常見的位點為12號密碼子G12D及G12V，分別占44.2%及36.5%。KRAS基因突變與AMNs類型、繼發(fā)性PMP級別、AJCC病理分級及分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管及神經(jīng)侵犯等代表腫瘤惡性度的臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)，提示KRAS基因的高頻突變可能是AMNs的早期分子事件，與AMNs的進展及侵襲無關(guān)。

關(guān)于KRAS基因突變在AMNs疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，目前研究極少。AMNs及PMP顯著特征是具有大量黏液性腹腔積液，黏蛋白是其重要成分，包括MUC2、MUC5B、MUC5AC[12]。MUC2、MUC5AC基因與MUC5B和MUC6共同形成MUC基因串，定位于11p15.5。多項體外實驗提示MAPK信號通路可能是調(diào)控MUC2和MUC5AC過表達的重要機制。Bae等[13]研究證實，在人呼吸道上皮細胞中細菌產(chǎn)物通過MAPK通路誘導MUC5AC過表達。Dilly等[14]研究證實，在分泌MUC2的細胞系LS174T及小鼠腹腔內(nèi)PMP異種移植模型中，使用MEK抑制劑可以減少MUC2的產(chǎn)生和黏液性腫瘤的生長。

KRAS基因突變在結(jié)直腸癌、肺癌患者的研究，已促使個體化治療進入了分子靶向治療的新時期。國內(nèi)外結(jié)直腸癌診治指南中明確提出分子靶向藥物的治療前提需檢測KRAS基因突變的狀態(tài)，KRAS基因突變將導致患者不能從抗EGFR靶向藥物的治療中獲益。AMNs及繼發(fā)性PMP目前的治療手段匱乏，僅局限于細胞減滅手術(shù)及腹腔熱灌注化療。本研究證實中國人的AMNs同樣存在高頻突變，臨床可探索研究使用MEK抑制劑阻斷該信號通路，進而抑制黏液的產(chǎn)生，達成治療PMP的目的。

綜上所述，AMNs及繼發(fā)性PMP是一類罕見的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病機制尚不明確。本研究證實中國人AMNs中存在KRAS基因的高頻突變，提示KRAS基因突變可能參與了AMNs的發(fā)病，臨床可探索針對KRAS基因突變的靶向治療。