柳 卓，田雪飛，郜文輝，譚小寧，翦慧穎，李可心，張 振，曾普華1，△

（1.湖南省中醫(yī)研究院，長沙 412000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 412006；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 412000）

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第6位，死亡率占惡性腫瘤第4位［1］。其高致死率對我國人民健康造成極大的威脅。目前肝癌的治療主要以手術(shù)和放化療為主，具有生物復(fù)雜性和治療手段的局限性，同時還面臨費用高，起效慢，易復(fù)發(fā)毒副作用大等特點。因此，肝癌治療亟待安全、經(jīng)濟、有效的藥物。

能量代謝正成為當(dāng)前腫瘤研究熱點，細(xì)胞能量代謝重編程（有氧糖酵解、線粒體能量代謝異常）是腫瘤細(xì)胞代謝的重要特征，其產(chǎn)生的能量主要用于腫瘤的快速擴增與遷移［2］。線粒體是機體能量代謝的細(xì)胞器，是腫瘤細(xì)胞快速增殖的重要介質(zhì)?；谀[瘤細(xì)胞能量代謝為靶點，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，有望成為惡性腫瘤臨床治療的新靶點?！肮唐⑾e飲”原名益氣化瘀解毒方是我院國醫(yī)大師潘敏求教授團隊治療肝癌的經(jīng)驗方，以四君子湯為基礎(chǔ)方加減，由白參、白術(shù)、半枝蓮、莪術(shù)、茯苓、黃芪、石見穿組成。具有益氣化瘀、散結(jié)解毒之功效。前期研究表明該方具有帶瘤生存，改善患者生存狀況的療效［3］。動物研究表明其具有抑制移植瘤生長，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬和凋亡的作用［4］，但其凋亡作用的機制尚未明確。

本實驗體外培養(yǎng)HepG2研究固脾消積飲含藥血清對肝癌細(xì)胞凋亡的作用機制，為其臨床療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物

HepG2細(xì)胞為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。所有實驗動物遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物質(zhì)量管理辦法》，SPF級SD大鼠10只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，動物購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（湘）2019-0004。本動物實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號2019-0072。

1.2 藥物及試劑

固脾消積飲白參10 g、黃芪30 g、半枝蓮30 g、重樓15 g、醋莪術(shù)15 g、甘草5 g購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。DMEM高糖培養(yǎng)基（Procell公司，批號：WH0021K261），小牛血清（CELL-BOX公司，批號：20201118），CCK8試劑盒（APExBIO公司，批號：K1018），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Elabscience公司，批號：E-IR-R305），增強型線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C2003S），周期與凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1052），Bax抗體（Elabscience公司，批號：E-AB-10049），Bcl-2抗體（Elabscience公司，批號：E-AB-22004），Caspase-3抗體（Elabscience公司，批號：E-AB-22115）；Seahorse XF RPMI培養(yǎng)基（美國Agilent公司，批號：00620006）；丙酮酸、葡萄糖ELISA試劑盒（南京建成生物工程公司，批號A081、F006）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（英國Abcam公司，批號GR33333591）；糖酵解速率測定試劑盒（美國Agilent公司，批號26817104）；三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）ELISA檢測試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號201651、206021）。

1.3 儀器

DxFLEX型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter有限公司）；Multifuge XIR型超低溫低速離心機（德國ThermoFisher）；EIX808U型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Mini Protean 3 Cell型電泳儀（美國Bio-Rad）；GBox XRQ型凝膠成像儀（中國Gene公司）；Seahorse XFe96型能量代謝分析儀（美國Agilent公司）。

1.4 固脾消積飲含藥血清的制備

飲片冷水浸泡30 min，煎煮2次，將藥液混合后過濾，濃縮至成人3倍劑量，再將藥物濃縮至100 ml含生藥1.8 g/ml，取10只SD大鼠，中藥組5只，按相當(dāng)于成人120 g/d等效量換算，每日灌胃量21.6 g/kg；空白組5只，用等體積蒸餾水灌胃；連續(xù)5 d，灌胃后第6日腹主動脈取血，收集兩組大鼠的血清，-80℃保存、備用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HepG2用10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。細(xì)胞共設(shè)4組：對照組（Control）、空白血清組（Blank）、固脾消積飲血清組（GPXJY）和順鉑組（Positive），每組設(shè)置6～10個復(fù)孔?？瞻籽褰M加入10%空白血清，中藥組分別加入10%固脾消積飲含藥血清培養(yǎng)基，順鉑組培養(yǎng)基中加入20μg/ml順鉑，于5%CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.6 細(xì)胞活力檢測試劑盒（CCK8）檢測細(xì)胞活性

HepG2細(xì)胞按照1.5分組干預(yù)后，棄掉上清，每孔加入CCK8，37℃培養(yǎng)2 h，于450 nm波長處，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值（OD值）。

1.7 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法檢測凋亡情況

在12孔板上，按照1.5共培養(yǎng)分組和干預(yù)后，棄掉上清，每孔加入相應(yīng)DAPI，染10 min后，PBS洗后顯微鏡下觀察。

1.8 Tunel檢測HepG2細(xì)胞凋亡情況

每組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，充分固定后，PBS清洗2×3 min次，Triton X-100封閉5 min，用PBS清洗2×3 min，配檢測液后每孔加入50 μl，37℃避光60 min孵育，PBS洗2×3 min后，在熒光顯微鏡下拍照。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測人肝癌Hep G2細(xì)胞周期

各組加入等體積藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，1 000 r/min左右離心3 min，沉淀細(xì)胞。用PBS清洗2次。向400μl細(xì)胞懸液中加入400μl結(jié)合緩沖液和10μl AnnexinV-FITC（20μg/ml），混勻，4℃避光孵育15 min后，在向細(xì)胞懸液中加入5μl碘化丙啶（PI）（20μg/ml），混勻。4℃避光孵育5 min，室溫放置10 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.10 JC-1線粒體檢測試劑盒檢測人肝癌HepG2細(xì)胞線粒體膜電位

取各組細(xì)胞懸液1 ml（含1×106細(xì)胞），以冷PBS洗滌細(xì)胞，100μl PBS液懸浮細(xì)胞，加入JC-1染色工作液，37℃孵育20 min，600 r/min 4℃離心3 min，沉淀細(xì)胞，重復(fù)三次，用JC-1重懸后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位，結(jié)果以平均熒光強度表示。

1.11 細(xì)胞上清液膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）含量檢測

取各組上清液按照說明書檢測細(xì)胞上清液TG和TC含量。

1.12 脂質(zhì)過氧化物（MDA）的檢測

使用蛋白酶消化細(xì)胞，收集每組細(xì)胞。按照脂質(zhì)過氧化MDA檢測試劑盒說明書，95℃下60 min孵育，冰浴10 min，酶標(biāo)儀檢測。

1.13 細(xì)胞糖酵解速率測定

藥物干預(yù)后細(xì)胞，每孔加入XF RPMI培養(yǎng)基，再將細(xì)胞放入無CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h等待上機檢測，按照糖酵解速率試劑盒步驟進行檢測。

1.14 葡萄糖代謝檢測

取各組細(xì)胞上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測丙酮酸和葡萄糖含量

1.15 蛋白免疫印記法（Western blot）檢測

BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)（BCL2-Associated X，Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）蛋白按照1.5共培養(yǎng)分組和干預(yù)后，提取蛋白，取含有100μg總蛋白的細(xì)胞裂解產(chǎn)物進行電泳，5%脫脂奶粉進行封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，清洗后二抗搖床孵育2 h，清洗后用凝膠成像。

1.16 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 固脾消積飲對HepG2細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞處理24 h后，光密度OD（optical density）檢測的結(jié)果顯示，與空白對照組比較，順鉑組和固脾消積飲組細(xì)胞明顯被抑制（P＜0.05，表1）。同時，DAPI染色結(jié)果顯示，固脾消積方含藥血清對HepG2細(xì)胞的抑制作用較明顯，細(xì)胞數(shù)變少（圖1）。各組給予相應(yīng)濃度藥物，分別作用于HepG2細(xì)胞24 h后，檢測其光密度OD（optical density）。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，順鉑組和固脾消積飲組細(xì)胞明顯被抑制（P＜0.05）。

DAPI染色結(jié)果如圖1顯示，固脾消積方含藥血清對HepG2細(xì)胞的抑制作用較明顯，細(xì)胞數(shù)變少。

Fig.1 DAPI staining of HepG2 cells treated with medicated serum in each group（×200）

2.2 固脾消積飲對HepG2形態(tài)的影響

凋亡細(xì)胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）實驗表明，固脾消積飲血清和順鉑血清組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組和無含藥血清（P＜0.01，表1，表2）。

Tab.1 Positive expression rate of OD and TUNEL cells in each group（±s，n=8）

Tab.1 Positive expression rate of OD and TUNEL cells in each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group OD value Apoptosis index（%）Control 1.14±0.09 8.23±1.23 Blank 1.05±0.12 9.23±2.42 GPXJY 0.33±0.09* 40.24±4.23**Postive 0.32±0.12* 42.21±3.25**

Fig.2 TUNEL apoptosis of cells in each group

2.3 固脾消積飲對HepG2周期的影響

細(xì)胞周期表明，固脾消積飲血清組和順鉑血清組HepG2細(xì)胞G0-G1期的百分率比對照組大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），固脾消積飲血清組和順鉑血清組HepG2細(xì)胞S期的百分率降低，無統(tǒng)計學(xué)意義。固脾消積飲血清組和順鉑血清組HepG2細(xì)胞G2-M期降低，無統(tǒng)計學(xué)意義（表2，圖3）。

Tab.2 Cell cycle and apoptosis in each group（%，±s，n=8）

Tab.2 Cell cycle and apoptosis in each group（%，±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group G0-G1 S G2-M Control 30.92±0.43 43.12±1.54 21.83±1.43 Blank 49.43±2.78 40.26±2.41 23.20±2.72 GPXJY 67.52±4.32**16.15±1.57 11.22±1.94 Postive 61.26±5.32*20.02±1.43 17.94±1.21

Fig.3 Results of cell cycle and apoptosis in each group

2.4 固脾消積飲對Hep G2細(xì)胞線粒體膜電位的作用

線粒體膜電位顯示，與對照組比較，固脾消積飲和順鉑血清組線粒體膜電位依次下降（P＜0.01，表3，圖4）。

Fig.4 Mitochondrial membrane potential of cells in each group

2.5 固脾消積飲對HepG2能量代謝的影響

2.5.1 固脾消積飲對HepG2脂質(zhì)代謝的影響 與對照組相比，空白組TG和TC無變化，中藥組和順鉑組TG和TC含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01，表3）。

2.5.2 固脾消積飲對HepG2的糖酵解功能和MDA水平的影響 與對照組相比，空白組糖酵解和MDA含量無明顯變化，中藥組和順鉑組糖酵解功能明顯降低，MDA含量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01，表4）。

2.5.3 固脾消積飲對HepG2的丙酮酸和葡萄糖的影響 與對照組相比，空白組丙酮酸含量和葡萄糖含量無變化，中藥組和順鉑組上清液丙酮酸含量明顯增加，葡萄糖含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01，表5）。

2.6 固脾消積飲對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的影響

與對照組相比較，固脾消積飲和順鉑組的Bax、Caspase-3表達顯著增高，固脾消積飲和順鉑組中Bcl-2蛋白表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，表6，圖5）。

Tab.3 Mitochondrial membrane potential and comparison of TG and TC contents in cells of each group（±s，n=8）

Tab.3 Mitochondrial membrane potential and comparison of TG and TC contents in cells of each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group Membrane potential TG（mmol/L）TC（mmol/L）Control 71.11±2.14 1.40±0.05 1.86±0.05 Blank 60.03±3.14 1.46±0.03 1.82±0.11 GPXJY 27.54±1.32**1.02±0.07*1.42±0.07**Postive 17.47±1.25**1.06±0.05**1.40±0.05*

Tab.4 Comparison of glycolytic function and MDA level of cells in each group（±s，n=8）

Tab.4 Comparison of glycolytic function and MDA level of cells in each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group PER（mpH/min） MDA（mmol/L）Control 809.7±13.9 0.62±0.05 Blank 798.3±18.7 0.75±0.01 GPXJY 472.2±26.7** 1.03±0.01*Positive 463.1±26.5* 1.08±0.05**

Tab.5 Comparison of pyruvate and glucose contents in cells of each group（±s，n=8）

Tab.5 Comparison of pyruvate and glucose contents in cells of each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group Pyruvic acid（mmol/L）Glucose（×102μmol/mg）Control 15.69±0.16 2.09±0.03 Blank 16.09±0.05 2.02±0.02 GPXJY 19.48±0.09** 1.25±0.08**Postive 19.09±0.08* 1.21±0.05**

Tab.6 Expression of Bax，Bcl-2 and caspase-3 proteins in each group（±s，n=10）

Tab.6 Expression of Bax，Bcl-2 and caspase-3 proteins in each group（±s，n=10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group BAX Bcl-2 Caspase-3 Control 0.89±0.03 1.33±0.05 1.03±0.04 Blank 0.91±0.02 1.14±0.04 1.04±0.09 GPXJY 1.63±0.08*0.48±0.03**1.85±0.04*Postive 1.71±0.03*0.46±0.05**1.79±0.04*

Fig.5 Protein expressions of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in each group

3 討論

細(xì)胞凋亡可以有效抑制腫瘤細(xì)胞生長和繁殖，從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可以在殺滅癌細(xì)胞的同時有效的避免對正常細(xì)胞的損害。因此，其是一種能有效的抑制癌細(xì)胞增殖的重要手段。凋亡常表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞器發(fā)生變化以及凋亡小體出現(xiàn)等［5］。線粒體、死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是凋亡發(fā)生的三種機制，通過凋亡信號誘導(dǎo)程序性死亡路徑，從而使得腫瘤疾病得以有效治療［6］。本研究結(jié)果顯示，固脾消積飲對肝癌細(xì)胞有抑制作用，TUNEL實驗顯示固脾消積飲干預(yù)細(xì)胞組凋亡陽性細(xì)胞明顯增多。流式結(jié)果顯示固脾消積飲血清組G1期的百分率比對照組大。表明固脾消積飲可能是通過阻滯HepG2細(xì)胞G1期而抑制癌細(xì)胞的增殖作用。

線粒體跨膜電位與細(xì)胞凋亡間關(guān)系密切，是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對稱分布造成。線粒體是能維持電化學(xué)質(zhì)子梯度、進行氧化磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［7］。正常生理情況下線粒體內(nèi)膜通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過。在細(xì)胞凋亡早期線粒體外膜蛋白質(zhì)的通透性增高，線粒體膜電位降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。細(xì)胞凋亡中線粒體起著重要作用，而這一過程是通過Bax、Bcl-2家族平衡來調(diào)控［9］。Bcl-2基因可抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生存期。Bax則是具有對抗Bcl-2蛋白作用，促進細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。Caspase-3是凋亡途徑的效應(yīng)分子，在線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中受凋亡信號的刺激下，其上游信號分子作用于線粒體膜，線粒體膜通透性發(fā)生反應(yīng)，引起凋亡［10］。本實驗結(jié)果表明，固脾消積飲含藥血清處理人肝癌細(xì)胞后，線粒體膜電位下降，凋亡率增加，并對線粒體凋亡相關(guān)的通路蛋白Bcl-2表達降低，Bax、Caspase-3表達增高。由此可推測，固脾消積飲可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP獲得大量能量，有氧糖酵解是腫瘤細(xì)胞最具特征的代謝表型，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供能量［11］。實驗表明，抑制癌細(xì)胞的糖酵解和脂質(zhì)代謝等能量代謝，可以促進腫瘤細(xì)胞的凋亡［12-14］。本實驗表明，固脾消積飲血清干預(yù)TG和TC含量顯著減少，糖酵解功能明顯降低，MDA含量明顯增加，丙酮酸含量明顯增加，葡萄糖含量明顯減少。由此可推測，固脾消積飲可能對肝癌細(xì)胞能量代謝有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，我們通過體外實驗證實固脾消積飲能促進肝癌細(xì)胞凋亡，其作用可能跟線粒體途徑和調(diào)節(jié)能量代謝有關(guān)。下一步將進一步對體內(nèi)實驗進行驗證，并聯(lián)合放化療藥物進一步探討。