李林芳，呂鑫鈺，邱玉玲，孔德新△

（1.天津市天津醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300200；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，天津 300070；3.天津天獅學(xué)院醫(yī)學(xué)院，天津 301700）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）所導(dǎo)致的心腦血管疾病是全球范圍內(nèi)位居前列的死亡原因之一［1］。近年來，AS發(fā)生率呈逐年增加態(tài)勢，發(fā)病群體也越來越年輕化。

AS的病理過程相當(dāng)復(fù)雜，大量泡沫細胞死亡而裂解成纖維帽，不穩(wěn)定的斑塊碎裂，進而阻塞管腔［2］，導(dǎo)致動脈瘤、冠心病、腦梗死等并發(fā)癥，危害人類健康［3］。

針對動脈粥樣硬化臨床表現(xiàn)和特點，中醫(yī)理論體系將之歸為“胸痹”、“眩暈”、“中風(fēng)”、“脈痹”等證，近年來有關(guān)于“毒邪致病”的理論報道［4］。中醫(yī)藥界在此基礎(chǔ)上辯證論治，把防治AS的常見中藥總結(jié)為如下幾種：清熱解毒類、補益類、活血化瘀類。芪貞元丹是一個用于治療高血脂和動脈粥樣硬化的臨床驗方，含黃芪、女貞子、延胡索與丹參，其中黃芪與女貞子為補益組分，補益正氣，增強體質(zhì)，抵御外邪；延胡索和丹參為活血組分，通利血脈、促進血行、消散瘀血。補益組分中黃芪為補氣要藥，適用于補氣升陽，固表止汗，行滯通痹，托毒排膿等；女貞子為補陰藥，用于滋補肝腎，明目烏發(fā)。活血組分中的延胡索為活血鎮(zhèn)痛藥，用于活血，行氣，鎮(zhèn)痛；丹參是活血涼血藥，用于活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。

經(jīng)過文獻挖掘研究表明，黃芪可以提高人外周血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的增殖、增強其遷移能力、黏附能力［5］；女貞子能降低實驗動物血清中的膽固醇和甘油三酯水平，從而消減AS斑塊，并降低AS發(fā)生率［6］；延胡索則對實驗動物動-靜脈旁路誘發(fā)的血栓有抑制作用［7］；丹參能減少動脈粥樣硬化的實驗動物主動脈血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達［8］等。大量實驗研究為芪貞元丹治療AS提供佐證，但中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，芪貞元丹是如何協(xié)同多成分、多靶點、多途徑對抗AS的，仍需進一步探討。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究手段具有整體性、系統(tǒng)性的這一特征，并結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的辨證論治理論，進一步發(fā)掘芪貞元丹組方治療AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、UniProt數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（www.genecards.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）、Cytoscape3.8.0軟件、Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）。

1.2 芪貞元丹初選化學(xué)成分和靶點的篩選

運用數(shù)據(jù)庫TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取芪貞元丹復(fù)方中四味中藥全部化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，得到的化學(xué)成分可能具有對抗AS的作用，作為芪貞元丹復(fù)方的初選化學(xué)成分，并查詢初選化學(xué)成分所對應(yīng)的靶點蛋白名。

1.3 藥物靶點的標(biāo)準(zhǔn)化

在UniProt數(shù) 據(jù) 平 臺（https：//www.uniprot.org/）上檢索芪貞元丹靶點蛋白名，校正物種來源為Human，將蛋白名進行基因名標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 AS疾病靶點的預(yù)測

運用OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)、和TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以疾病名稱“atherosclerosis”搜索，分別刪除重復(fù)項，以Excel形式存檔備用；運用GeneCards（www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以疾病名稱“atherosclerosis”搜索，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中“relevance score”得分排序，選取與AS相關(guān)性較大的前1 000個靶點進行研究，以Excel形式存檔備用，三個數(shù)據(jù)庫所得數(shù)據(jù)截止時間為2020年7月，將三個數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果合并后再次刪除重復(fù)項，獲取與AS相關(guān)的疾病靶點。

1.5 芪貞元丹治療AS的作用靶點預(yù)測

利用Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）對1.3和1.4所得數(shù)據(jù)求交集，獲得芪貞元丹-AS共同靶點，作為作用靶點。

1.6 “藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

1.5中作用靶點所對應(yīng)的初選化學(xué)成分，為最終對抗AS的活性成分，將活性成分、作用靶點分別以Excel形式存檔，整理好對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 芪貞元丹治療AS的作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)平臺對芪貞元丹治療AS的作用靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)作用分析，物種限定為“Homo sapiens”，置信度分值為0.4，用Cytoscape 3.8.0進行可視化分析。

1.8 GO功能分析與KEGG通路富集分析

將作用靶點上傳至Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）數(shù)據(jù)庫，篩選要求是Log10（P）＜0.1，并把GO生物過程和KEGG信號通路按P-Value［-Log10（P）］值大小排序，選取數(shù)值較大的前20位。

1.9 “活性成分-作用靶點-KEGG信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

建立“活性成分-作用靶點-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)。以電子表格的形式上傳至Cytoscape3.8.0進行網(wǎng)絡(luò)可視化。

2 結(jié)果

2.1 芪貞元丹活性成分的篩選

檢索得到：黃芪的初選化學(xué)成分20個、女貞子的初選化學(xué)成分13個、延胡索的初選化學(xué)成分49個、丹參的初選化學(xué)成分65個，合并重復(fù)成分后共獲得143個初選化學(xué)成分，再輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫后，共獲得271個藥物靶點，其中，有255個靶點通過UniProt數(shù)據(jù)平臺成功轉(zhuǎn)換為基因名。

2.2 疾病靶點的篩選

利用OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)、GeneCards（www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)和TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以疾病名稱“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞進行檢索，OMIM檢索到AS疾病靶點484個，GeneCards篩選得到AS疾病靶點1 000個，TTD檢索到AS疾病靶點22個，合并后去掉重復(fù)項后共獲得1364個疾病靶點。

2.3 藥物治療AS作用靶點的預(yù)測

利用Venny 2.1繪制韋恩圖，得到芪貞元丹與AS共有靶點蛋白共118個，作為芪貞元丹組方治療AS的作用靶點（圖1）。

2.4 “藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中，共包含245個節(jié)點，1 501條邊，其中，代表藥物的節(jié)點4個，代表活性成分的節(jié)點123個，代表作用靶點的節(jié)點118個。藥物、活性成分、作用靶點之間通過“邊”相關(guān)聯(lián)，黃芪中的14個活性成分與103個作用靶點相關(guān)聯(lián)，女貞子中的8個活性成分與97個作用靶點相關(guān)聯(lián)，延胡索中49個活性成分與103個作用靶點相關(guān)聯(lián)，丹參中56個活性成分與64個作用靶點相關(guān)聯(lián)，復(fù)方中每個活性成分平均作用于11.20個作用靶點，每個作用靶點關(guān)聯(lián)的活性成分為5.04個，表明藥物的活性成分與作用靶點之間存在著一對多的對應(yīng)關(guān)系，而作用靶點也同時存在于多個活性成分中?；钚猿煞种心鞠菟貫榈?、女貞子所共有，槲皮素為黃芪、女貞子、延胡索所共有，山奈酚為黃芪、女貞子所共有，并且通過計算Degree值，可知這三種活性成分相關(guān)聯(lián)的作用靶點最多，見表1（Degree值前十位），表明這三種活性成分具有關(guān)鍵作用。

Fig.1 Venn diagram of targets of herbs and diseaseTab.1 The key active ingredients in QiZhenYuanDan and their Degree values

2.5 藥物治療AS作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將118個作用靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫平臺，以收集蛋白互作關(guān)系相關(guān)數(shù)據(jù)，然后通過Cytoscape 3.8.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Degree值調(diào)節(jié)節(jié)點大?。▓D2）。節(jié)點圖形越大，表示與之產(chǎn)生互作關(guān)系的的靶點越多，邊越粗，表示靶點蛋白之間的相互作用越強。

Fig.2 PPI network of active targets

根據(jù)度值排序，選取排在前十位的靶點，見表2，再次運用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，這十個靶點可能為芪貞元丹組方治療AS的關(guān)鍵靶點（圖3）。

2.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析

利 用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）數(shù)據(jù)平臺，分析芪貞元丹-AS作用靶點的GO生物過程和KEGG信號通路富集過程。

Tab.2 Top 10 targets of degree in PPI network

Fig.3 PPI network of key targets

將118個作用靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫，然后依次進行GO Biological Processes（生物過程）、GO Cellular Components（細胞組成）、GO Molecular Functions（分子功能）分析，根據(jù)P-Value［-Log10（P）］值由大至小的排序，最后選取前20個GO生物過程分析條目，并將其上傳至易漢博生物信息平臺（http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html）進行數(shù)據(jù)可視化處理（圖4）。GO分析結(jié)果提示芪貞元丹治療AS的作用靶點顯著富集在對無機化合物的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細胞對脂質(zhì)的反應(yīng)等生物過程中（圖4A）；分子功能主要在細胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等過程中有所體現(xiàn)（圖4B）；在細胞組成中膜筏、囊泡、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、受體復(fù)合物、細胞外基質(zhì)等占比最大（圖4C）。

同樣，共獲得155條KEGG信號通路，根據(jù)PValue［-Log10（P）］值從大到小的順序，選取前20個KEGG信號通路上傳至易漢博生物信息平臺，得到KEGG的氣泡圖（圖5）。分析氣泡圖顯示，KEGG顯著富集在細胞流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等疾病相關(guān)信號通路以及磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等信號通路上。富集結(jié)果表明，芪貞元丹可能通過上述信號通路發(fā)揮治療作用。

2.7 “活性成分-作用靶點-KEGG信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)整理，將“藥物活性成分-作用靶點-KEGG信號通路”互作關(guān)系對應(yīng)匹配，上傳至Cytoscape 3.8.0軟件可視化，網(wǎng)絡(luò)圖表明，芪貞元丹組方中各活性成分通過“多靶點、多信號通路”協(xié)同互作發(fā)揮治療AS的作用。

3 討論

中醫(yī)藥由于具有整體調(diào)節(jié)、多靶優(yōu)效和毒副作用小等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于AS相關(guān)科研與臨床實踐工作中。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果表明，芪貞元丹治療AS的活性成分主要有10個，分別為槲皮素、山奈酚、木犀草素、芒柄花素、丹參酮ⅡA、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、異鼠李素、二氫丹參內(nèi)酯、丹參新醌D、4-亞甲丹參新酮。槲皮素可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt、NF-κB p65等信號通路抑制細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達，改善血管內(nèi)皮細胞功能，降低AS中的炎癥反應(yīng)，延緩AS過程［9］。山奈酚可減少巨噬細胞衍生趨化因子（macrophage derived chemokine，MDC）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon induced protein-10，IP-10）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等炎癥因子形成，抑制炎癥的發(fā)生［10］；降低動脈血中ICAM-1、VCAM-1、整合蛋白、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等黏附分子的基因水平和蛋白水平，抑制MAPK信號通路，降低血管炎癥反應(yīng)，具有防止AS發(fā)生的潛在功能［11］。木犀草素可以降低臭氧和活性氮類成分的合成，從而影響花生四烯酸的代謝和炎性相關(guān)通路的表達［12］，同時可以降低的白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、IL-6等炎癥因子的形成，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平［13］，發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用。這幾種活性成分在芪貞元丹復(fù)方抗AS過程中發(fā)揮重要作用。由此可知，芪貞元丹可能是通過其活性成分與靶點、信號通路交互作用，降低AS中的炎癥反應(yīng)，延緩AS發(fā)病進程的。

Fig.4 Visualization results of GO pathway enrichment

Fig.5 Visualization results of KEGG signaling pathway

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果表明，芪貞元丹可能是通過IL-6、蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等藥物-疾病共有靶點發(fā)揮治療AS作用。白細胞介素-6基因名為IL-6，T細胞、上皮細胞、B細胞及血管內(nèi)皮細胞等都能分泌IL-6，在AS的發(fā)病過程中，IL-6主要參與機體的各種炎癥反應(yīng)［14］。VEGFA可通過作用于炎性細胞和內(nèi)皮細胞間接參與瘢痕的生成，也可作用于人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblast，HSF）直接參與到瘢痕的生成［15］。此外，靶點蛋白互作過程還可能與多種脂蛋白及血管內(nèi)皮炎性因子等相關(guān)，如AKT1、TNF、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等，而AS發(fā)病過程又與脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等相關(guān)，證明芪貞元丹作為中藥復(fù)方，其成分復(fù)雜性的特點，使其能通過多分子、多靶點、多途徑相互作用發(fā)揮抗AS的效果。

結(jié)合GO生物過程分析和KEGG富集分析的結(jié)果提示，芪貞元丹治療AS，是多種復(fù)雜的生物過程富集在不同信號通路上，各通路共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。結(jié)果顯示有PI3K-Akt、NF-κB、HIF-1等信號通路和炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）通路等，這些通路都能影響脂代謝、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞凋亡等過程。PI3K-Akt信號通路在細胞中廣泛存在，磷酸化活化后，誘發(fā)第二信促使AKT磷酸化，磷酸化AKT可以促增殖、抗凋亡，并且能夠抑制氧化應(yīng)激［16］。NF-κB信號通路與機體免疫及炎癥反應(yīng)的關(guān)系密切。NF-κB作為一種蛋白復(fù)合物，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其主要亞型是P50和P65，即NF-κB1和Rel A，通過TNF-α、IL-1、脂多糖（Lipopo-lysaccharide，LPS）等刺激因子的活化，誘導(dǎo)多種相關(guān)基因的表達，產(chǎn)生多種細胞因子參與炎癥反應(yīng)［17，18］。HIF-1信號通路是一條重要的信號通路，在集體對低氧代償?shù)谋姸嗾{(diào)節(jié)機制中，HIF-1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在生理和病理條件下，能夠調(diào)整多種基因的表達，在機體低氧和缺血的狀態(tài)下發(fā)揮保護作用，從而降低心肌酶活性，改善心肌組織形態(tài)，抑制心肌細胞死亡，降低心梗面積，改善心肌缺陷再灌損傷效果［19］。此外，KEGG富集結(jié)果中Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Transcriptional misregulation in cancer等癌癥相關(guān)通路富集較高。有研究表明，內(nèi)皮損傷反應(yīng)可能是腫瘤與AS發(fā)生的共同誘因，腫瘤細胞浸潤血管內(nèi)皮，損傷血管內(nèi)皮細胞，當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，釋放組織因子（tissue factor，TF），促進局部血栓形成。同時，腫瘤細胞還能激活凝血系統(tǒng)，致凝血和纖溶功能的異常，凝血活性亢進，外周血中D-二聚體升高，如肺癌、直腸癌、肝癌、卵巢癌等，使患者發(fā)生深靜脈血栓的風(fēng)險增加［20］。同時結(jié)果顯示，與Malaria、Inflammatory bowel disease等信號通路的相關(guān)性，提示瘧疾、炎性腸病可能與AS的某些信號通路可能是共通的，有共同的致病誘因，也提示我們在研究其抗AS作用的同時應(yīng)留意可能產(chǎn)生的副作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，分析芪貞元丹治療AS是多成分—多靶點—多途徑協(xié)同作用的過程。結(jié)果表明，該復(fù)方中的槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分作用于IL-6、PI3K-Akt、VEGFA等靶點，通過抗細胞凋亡、抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)等發(fā)揮抗AS作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突