馬利節(jié)， 于 暢， 王 芳， 唐亦非， 鄔海龍， 孫學(xué)華， 高月求

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 a.肝病科， b.中心實驗室，上海 201203； 3 上海健康醫(yī)學(xué)院， 上海 201203

肝細胞癌是當(dāng)前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴重威脅我國人民的生命健康[1-2]。肝癌治療包括肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、局部消融治療、經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)、放射治療、全身治療等多種手段[3]。然而由于肝癌患者早期癥狀不明顯，多數(shù)確診時已屬中晚期，治療效果差，病死率高[4]。因此，為提高肝癌患者的生存率，進一步尋找新的藥物、生物免疫等治療方法成為近年的研究熱點。

柚皮素(4,5,7-三羥基黃酮)是一種類黃酮化合物，無色無味，主要存在于各種葡萄、漿果和柑橘類水果中[5]。柚皮素具有多種生物學(xué)作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤[6]等。其中，抗腫瘤活性是目前國內(nèi)外研究的一個熱點。有報道[7]提出柚皮素可增強自然殺傷(NK)細胞及細胞毒性T淋巴細胞活性，抑制巨噬細胞中的細胞氧化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

NK細胞是固有免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞，通過殺死感染、入侵、應(yīng)激或轉(zhuǎn)化的細胞，保護宿主。此外，NK細胞通過細胞相互作用發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng)。近年來，以NK細胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療取得重大進展，包括NK細胞過繼轉(zhuǎn)移治療、募集NK細胞至腫瘤微環(huán)境、阻斷限制NK細胞功能的抑制受體等[8]。本實驗探討柚皮素對人NK細胞殺傷人肝癌細胞株CLC5活性的影響，并初步分析其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 淋巴細胞分離液購自CEDARLANE(加拿大)；注射用重組人白細胞介素2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司；柚皮素(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜、青鏈霉素均購自美國Sigma公司；NK細胞培養(yǎng)基購自德國CellGro SCGM；CD56-APC、CD3-FITC購自美國BD公司；CellTiter-LumiTM、黑色96孔板均購自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK8試劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；流式細胞檢測儀購自美國Becton Dickinso公司；SpectraMax iD5酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司；RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、實時熒光定量PCR儀購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 人NK細胞的培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)知情同意，先后取3名健康志愿者外周抗凝血100 mL，分離單個核細胞(PBMC)。每100 mL外周抗凝血可分離約3×106PBMC，用含500 IU/mL rhIL-2的NK培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為5×105/mL，接種于6個25 cm2培養(yǎng)瓶中。每瓶NK細胞培養(yǎng)基加至5 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d半量換液1次，維持細胞密度為 5×105/mL，收集培養(yǎng)擴增15 d的NK細胞，加入FITC標(biāo)記的CD3、APC標(biāo)記的CD56進行細胞表面標(biāo)志檢測[9]，流式鑒定重復(fù)3次。

1.3 CCK8法檢測不同濃度柚皮素對肝癌細胞生長的影響 人肝細胞癌CLC5細胞(購自BRICS生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所蘇州研究院質(zhì)粒細胞庫)，編號：BRICS0004，以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將肝癌細胞配成5×104/mL的細胞懸液，100 μL/孔接種于96孔板，加入柚皮素(終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、24、48 h后，每孔加入CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔吸光值(OD)并記錄結(jié)果，同時計算肝癌細胞增殖率。肝癌細胞增殖率=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%。

1.4 CCK8法檢測不同濃度柚皮素對NK細胞生長的影響 由于CCK8試劑對懸浮細胞染色較為困難，將NK細胞配成2×105/mL的細胞懸液；100 μL/孔接種于96孔板，加入柚皮素(終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔OD值并記錄結(jié)果，同時計算NK細胞增殖率。NK細胞增殖率=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%。

1.5 CellTiter-LumiTM法檢測不同濃度柚皮素對NK細胞殺傷率的影響 胰酶消化肝癌細胞并計數(shù)，配成5×104/mL的細胞懸液，50 μL/孔接種于黑色96孔板；將NK細胞配成5×104/mL的細胞懸液，50 μL/孔同時接種于黑色96孔板，構(gòu)建NK-肝癌細胞1∶1共培養(yǎng)體系，每組6個復(fù)孔；加入柚皮素(終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)共培養(yǎng)24 h，取出細胞培養(yǎng)板室溫平衡10 min，每孔加入100 μL CellTiter-LumiTM試劑，室溫振蕩2 min促進細胞裂解后，室溫孵育10 min使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀進行化學(xué)發(fā)光檢測并記錄Luminescence值。NK細胞殺傷率=[1-(共培養(yǎng)孔-NK細胞孔)/肝癌細胞孔平均值]×100%[10]。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測柚皮素對NKG2D受體及配體的影響 胰酶消化肝癌細胞并計數(shù)，配成1×105/mL的細胞懸液，1 mL/孔接種于6孔板；將NK細胞配成1×105/mL的細胞懸液，1 mL/孔同時接種于6孔板，構(gòu)建NK-肝癌細胞1∶1共培養(yǎng)體系。柚皮素刺激24 h，收集細胞使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；SYBR Green實時熒光定量PCR法檢測NK細胞中NKG2D受體及肝癌細胞中NKG2DL(MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達水平，采用2-ΔΔCt法計算各mRNA相對表達量。引物由上海擎科生物工程股份有限公司合成，信息見表1。

2 結(jié)果

2.1 人 NK 細胞培養(yǎng)及鑒定 研究[11-12]表明，人NK細胞表型為CD3-CD56+；收集3名健康志愿者經(jīng)rhIL-2誘導(dǎo)的PBMC細胞進行流式檢測，培養(yǎng)15 d后NK細胞占PBMC比例為82.33%±0.70%(圖1)。

2.2 柚皮素對肝癌細胞的影響 柚皮素作用24 h后，所有濃度組CLC5肝癌細胞的增殖率均無明顯差異(P值均>0.05)；48 h后3.125～50 μmol/L濃度組CLC5肝癌細胞的增殖率較0 μmol/L濃度組(642.76%±30.44%)均有所下降(P值均<0.000 1)，且具有一定的濃度依賴關(guān)系。其中，3.125 μmol/L柚皮素組即有明顯抑制CLC5肝癌細胞增殖率(561.96%±42.84%)的作用(P<0.000 1)，50 μmol/L濃度組CLC5肝癌細胞增殖率(464.02%±13.15%)最低(P<0.000 1)(圖2)。

注：a， NK細胞流式鑒定；b， 顯微鏡下NK細胞形態(tài)。

注：與0 μmol/L濃度組相比，P<0.000 1。圖2 不同質(zhì)量濃度柚皮素對肝癌細胞增殖率的影響Figure 2 Effects of different naringin concentrations onviability of hepatocellular carcinoma cells

表1 實時熒光定量PCR引物列表Table 1 List of primers for fluorescence quantitative PCR

2.3 柚皮素對NK細胞的影響 根據(jù)本實驗研究目的，以及柚皮素作用24 h對肝癌細胞的增殖無明顯影響，僅觀察不同質(zhì)量濃度柚皮素作用NK細胞24 h后，對NK細胞增殖率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柚皮素作用24 h后，3.125～12.5 μmol/L質(zhì)量濃度組NK細胞的增殖率較0 μmol/L組均無明顯差異(P值均>0.05)；25 μmol/L濃度組柚皮素NK細胞的增殖率(109.89%±1.93%)較0 μmol/L組(100.17%±1.88%)即有升高(P<0.000 1)，50 μmol/L濃度組柚皮素對NK細胞增殖的促進作用(118.29%±2.34%)尤為突出(P<0.000 1)(圖3)。

注：與0 μmol/L濃度組相比，P<0.000 1。圖3 不同質(zhì)量濃度柚皮素對NK細胞增殖率的影響Figure 3 Effects of different naringin concentrations onviability of NK cells

2.4 柚皮素對NK細胞殺傷率的影響 柚皮素作用NK-肝癌細胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h后，3.125～12.5 μmol/L質(zhì)量濃度組NK細胞的殺傷率較0 μmol/L組均無明顯差異(P值均>0.05)；25 μmol/L濃度組NK細胞的殺傷率(44.75%±3.25%)較0 μmol/L組(32.70%±3.68%)即有升高(P<0.000 1)，50 μmol/L濃度組對NK細胞殺傷率的提高(46.79%±3.54%)較25 μmol/L濃度組無明顯差異(P>0.05)(圖4)。

2.5 柚皮素對NKG2D受體及配體的影響 根據(jù)以上實驗結(jié)果，以0 μmol/L柚皮素作為對照組，觀察25、50 μmol/L濃度組柚皮素對NK細胞中NKG2D受體及肝癌細胞中NKG2D配體(NKG2D ligand, NKG2DL)表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作用于NK-肝癌細胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h后，25、50 μmol/L濃度組柚皮素對NK細胞中NKG2D受體的表達均無影響(P值均>0.05)，對肝癌細胞中部分NKG2DL(MICB、ULBP2)的表達亦無影響(P值均>0.05)；25、50 μmol/L濃度組可促進肝癌細胞中部分NKG2DL(ULBP1、ULBP3)的表達(P值均<0.001)。而25 μmol/L與50 μmol/L濃度組柚皮素對肝癌細胞中ULBP1和ULBP3表達的上調(diào)均無明顯差異(P值均>0.05)(圖5)。

3 討論

近年來，中草藥及其提取物在減少腫瘤治療的副作用和改善免疫系統(tǒng)功能方面具有獨特優(yōu)勢[13-15]，從而延長癌癥患者的生存時間，提高生活質(zhì)量。柚皮素在防治腫瘤方面的潛在作用引起廣泛關(guān)注[16]。據(jù)報道，柚皮素可作為一種化學(xué)增敏劑，協(xié)同增強紫杉醇在前列腺癌細胞中的細胞毒作用[17]；并可與衣霉素BAY 11-7082結(jié)合有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡[18]。NK細胞是固有免疫的重要組成部分，是腫瘤細胞免疫治療的基礎(chǔ)[19-20]，NK細胞的抗腫瘤作用除了依賴其殺傷活性外，與其數(shù)量也有很大的關(guān)系。本實驗結(jié)果表明，柚皮素作用于NK細胞24 h后，25 μmol/L質(zhì)量濃度組NK細胞的增殖率逐漸上升，50 μmol/L時NK細胞增殖率達最高峰，提示一定濃度的柚皮素能夠促進NK細胞的增殖，其具體機制尚不清楚。

注：a, CellTiter-LumiTM檢測原理；b, 柚皮素對NK細胞殺傷率的影響。與0 μmol/L濃度組相比，P<0.000 1。

注：a, 柚皮素對NKG2D受體的影響；b, 柚皮素對NKG2DL的影響。

NKG2D是NK細胞和部分T淋巴細胞中的重要激活型受體。NKG2DL在大多數(shù)腫瘤細胞中特異性表達[21]。NKG2DL與NK細胞上的NKG2D結(jié)合將誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的細胞毒性從而破壞靶細胞。然而隨著病程的進展，一些腫瘤細胞通過配體脫落、配體保留和誘導(dǎo)鄰近細胞上的配體，以規(guī)避NKG2D介導(dǎo)的免疫監(jiān)測，這表明了NKG2D/NKG2DL的相互作用在腫瘤免疫反應(yīng)過程中的重要性，使NKG2D/NKG2DL在癌癥治療應(yīng)用中具有巨大的潛力[22]。本實驗結(jié)果表明柚皮素作用于NK-肝癌細胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h，當(dāng)濃度超過25 μmol/L時NK細胞的殺傷率較對照組上升，而25 μmol/L與50 μmol/L濃度組之間對NK細胞殺傷率的提高無明顯差異。25 μmol/L與50 μmol/L柚皮素分別作用于NK-肝癌細胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h，NK細胞中NKG2D的表達較之對照組無明顯差異，CLC5細胞中ULBP1及ULBP3的表達較之對照組升高，即柚皮素通過暴露肝癌細胞中NKG2DL，使其與NKG2D結(jié)合而促進NK細胞殺傷作用。

綜上所述，柚皮素不僅能夠促進NK細胞的增殖，而且能夠增加NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，其機制可能與柚皮素上調(diào)肝癌細胞中ULBP1、ULBP3等NKG2DL的表達有關(guān)，但其具體作用機制還有待進一步深入研究，上述結(jié)論為柚皮素應(yīng)用于肝癌的免疫治療提供了理論依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究于2018年11月20日通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理委員會審核批準，批號：2018-628-57-01。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：馬利節(jié)、于暢負責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；王芳、鄔海龍參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；唐亦非參與修稿事宜；孫學(xué)華、高月求負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。