廖良坤 楊勝濤 袁源 查云盛 和桂芳 肖魚

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室 廣東湛江524001；2.怒江綠色香料產(chǎn)業(yè)研究院 云南怒江 673200）

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜[（Alpinia zerumbet(Pers.)Burtt.et Smith）]的干燥成熟果實，是貴州、云南少數(shù)民族常用的民族藥材，具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧之功效，主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等，目前已有 200多年的栽培歷史[1]。艷山姜揮發(fā)油是從艷山姜的干燥成熟果實中提取得來，具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化以及防治心血管系統(tǒng)疾病等[2]。研究表明，艷山姜葉子的水提物和二氯甲烷提取物在體外有抗增殖活性，水醇提取物和二氯甲烷提取物對白血病和肺腫瘤細胞系顯示出抗增殖作用，表明艷山姜具有作為抗腫瘤藥物的潛質(zhì)[3]。目前關(guān)于艷山姜精油的活性研究主要集中于對心血管系統(tǒng)疾病和抗炎方面[4]，在艷山姜精油抑制癌細胞增殖方面研究較少。

本研究通過提取艷山姜精油，分析其揮發(fā)組分，并利用HepG2人肝癌細胞實驗，分析精油誘導(dǎo)癌細胞凋亡、抑制癌細胞增殖的效果，揭示其抗腫瘤作用。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試劑艷山姜，采自云南怒江州；HepG2人肝癌細胞系，購于上海中國科學(xué)院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco；胎牛血清，美國Gibco；DMSO，美國sigma；CCK-8試劑盒，美國Sigma；多功能酶標(biāo)儀，美國 Thermo Fisher；Annexin V-PE/7-AAD流式試劑盒，中國三箭；一抗：Caspase-3（兔來源）、Caspase-9（兔來源）、p53（兔來源）、PCNA（兔來源），英國Abcam；內(nèi)參一抗β-actin（兔來源），英國Abcam；RNA提取試劑盒，日本takara；氣相色譜質(zhì)譜儀，日本島津。

1.1.2 設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋；低速臺式離心機，上海安亭；倒置顯微鏡，Nikon，日本；流式細胞儀，美國BD；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置，美國Bio-Rad；Trans-Blot轉(zhuǎn)膜裝置，美國Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)，中國 Tanon；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀，美國ABI；激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon。

1.2 方法

1.2.1 艷山姜精油 GC-MS分析將水蒸氣蒸餾獲得的艷山姜精油10 μL溶解于1 mL甲醇中，利用0.22 μm尼龍膜過濾后，進行GC-MS分析。色譜條件：色譜柱HP-5 MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序為初始溫度50℃保持5 min，以5℃/min的速率升溫至50℃，再以8℃/min的速率升溫至230℃保持5 min，以20℃/min的速率升溫至280℃，保持5 min。載氣為He；載氣流量為1 mL/min，進樣口溫度290℃；進樣量1 μL；分流比為10∶1。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，質(zhì)譜掃描范圍為 35～550 m/z[5]。

1.2.2 HepG2細胞培養(yǎng)細胞為人類肝癌細胞HepG2，其培養(yǎng)基為威廉姆斯E（WME）全培養(yǎng)基，其中包含5%胎牛血清（FBS）、2 mmol/L谷氨酸鹽、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、0.05 μg/mL氫化可的松、5 μg/mL胰島素、100 μg/mL慶大霉素、50 μg/mL鏈霉素和 50 units/mL青霉素，將HepG2細胞在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，實驗使用的細胞代數(shù)為14～35代[6]。

1.2.3 不同濃度艷山姜精油處理HepG2細胞模型建立吸取250 μL艷山姜精油，質(zhì)量為0.229 4 g，計算密度為0.917 6 g/mL，因此吸取435.9 μL艷山姜精油，質(zhì)量為 0.4 g，加入無水乙醇 2 mL，得艷山姜精油母液濃度為0.2 g/mL。用胰酶消化細胞，計數(shù)調(diào)整細胞濃度至1×104個/mL，分別接種于96孔板中，每孔100 μL，每組細胞3個重復(fù)；將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2），待細胞貼壁后，利用不同精油處理細胞[7]。

1.2.4 CCK 檢測分別往上述96孔板培養(yǎng)的細胞中加入 400、200、100、50、25、0 μg/mL 的艷山姜精油，培養(yǎng)12、24、48 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1～4 h，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度值；設(shè)置空白孔（培養(yǎng)基、CCK8），對照孔（未經(jīng)處理的細胞、培養(yǎng)基、CCK8）[8]。

細胞抑制率=[A對照組-A實驗組]/[A對照組-A空白組]×100%

A實驗組：具有經(jīng)過處理的細胞的CCK8溶液的吸光度值；A空白組：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細胞的孔的吸光度值；A對照組：具有未經(jīng)過處理的細胞的CCK8溶液的吸光度值。

1.2.5 流式細胞分析用6孔板培養(yǎng)細胞，待細胞生長達到60%～70%，加入相應(yīng)濃度的精油處理HepG2細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集細胞培養(yǎng)基上清和沉淀，以2 000 r/min離心5 min；用PBS洗滌細胞2次，以2 000 r/min離心5 min，收集（1～5）×105個細胞；在 50 μL 的 Binding Buffer中加入5 μL 7-AAD染液，混勻；收集細胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；加入 450 μL的 Binding Buffer混勻，加入 1 μL AnnexinV-PE混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)，進行流式細胞儀檢測。Annexin V-PE的橙紅色熒光，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=578 nm；7-AAD紅色熒光，激發(fā)波長Ex= 546 nm，發(fā)射波長Em=647 nm[9]。

1.2.6 qPCR按照RNA提取試劑盒步驟，提取RNA，用分光光度儀測定濃度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照步驟將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，根據(jù)濃度稀釋適當(dāng)倍數(shù)，然后利用qPCR儀進行mRNA檢測。PCR擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，共計 40 個循環(huán)[10]?；虮磉_定量采用△Ct的方法，引物由Western Biotechnology公司合成，見表1。

表1 引物名稱和序列

1.2.7 數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)利用 Excel處理，顯著性采用SPSS方差分析，實驗重復(fù)3次，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 艷山姜精油GC-MS分析

將艷山姜精油按 1.2.1條件進行 GC-MS分析，得到艷山姜精油揮發(fā)性成分，用 NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索匹配，定性分析出50個揮發(fā)性成分(表1)，分別為烯烴類25個、醇類13個、醛類6個、酮類3個、其他芳烴化合物3個，共占總揮發(fā)組分的96.35%。艷山姜精油揮發(fā)組分主要為α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、石竹烯、δ-杜松烯、桉葉油醇等烯烴和醇類化合物；揮發(fā)組分中，烯烴占63.88%、醇類占19.52%、醛類占3.95%、酮類占2.99%。

表1 艷山姜精油揮發(fā)組分分析

2.2 艷山姜精油對細胞抑制率

艷山姜精油對HepG2癌細胞的抑制作用如圖1所示。由圖1可看出，艷山姜精油對HepG2細胞的抑制作用呈劑量依賴性，當(dāng)精油濃度在 25～200 μg/mL時，隨著精油濃度的升高，對 HepG2細胞的抑制作用增強，在200 μg/mL濃度下孵育12、24和48 h的細胞抑制率分別為21.4%、38.6%和56.8%；當(dāng)精油濃度在25～100 μg/mL時，孵育時間對精油的抑制率影響較小，孵育 12、24和48 h后，相同精油濃度條件下不同孵育時間的抑制率差異不顯著（p＞0.05），但當(dāng)精油濃度為200 μg/mL時，不同孵育時間對精油的抑制率影響顯著（p＜0.05）。

圖1 艷山姜精油對HepG2細胞抑制作用

續(xù)表1 艷山姜精油揮發(fā)組分分析

2.3 細胞凋亡分析

為探究艷山姜精油是否通過誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制HepG2腫瘤細胞的活性，采用流式細胞術(shù)測定不同濃度艷山姜精油處理引起的細胞凋亡，其中無精油處理時，細胞凋亡率為2.56%（圖2）；精油濃度為50 μg/mL時，細胞凋亡率為3.2%；精油濃度為200 μg/mL時，細胞凋亡率為6.2%，相較于未利用精油處理的細胞，凋亡率提升了2.5倍。艷山姜精油引起的HepG2細胞凋亡如圖3所示。

圖2 不同濃度艷山姜精油下HepG2的凋亡率

圖3 艷山姜精油對HepG2細胞凋亡的影響

2.4 基因表達分析

Caspase-3、Caspase-9、p53、PCNA的激活與細胞凋亡有關(guān)[11-12]，通過 qPCR檢測經(jīng)艷山姜精油處理的HepG2細胞每24 h的mRNA表達水平。如圖4所示，艷山姜精油在不同濃度下Caspase-3、Caspase-9、p53三種基因 mRNA 表達水平均提高，PCNA基因mRNA表達水平降低；在艷山姜精油濃度為200 μg/mL時，Caspase-3、Caspase-9、p53的mRNA基因表達水平分別提高至對照組的2.57、1.74、1.50倍，PCNA的 mRNA表達水平降低至對照組的0.45倍。caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[13]，在細胞凋亡中起著不可替代的作用，caspase-3基因表達顯著提升（p=0.05），表明艷山姜精油具有促進HepG2細胞凋亡的作用。Caspase 9是參與啟動細胞程序性死亡的蛋白酶，可以引起細胞死亡，經(jīng)艷山姜精油處理后，Caspase 9基因表達提升了 1.74倍，說明艷山姜精油能促進 HepG2細胞程序性死亡。p53介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細胞正常生命活動中起重要作用，是重要的腫瘤抑制基因，能使癌細胞凋亡，從而防止癌變[14]。HepG2細胞經(jīng) 200 μg/mL的艷山姜精油處理后，p53基因表達提高了1.50倍，表明精油的處理促進了p53途徑作用的發(fā)揮，有利于癌細胞凋亡。PCNA與細胞 DNA合成關(guān)系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[15]；經(jīng)精油處理后，PCNA的表達顯著降低（p＜0.05），表明癌細胞的增殖受到較好的抑制。

圖4 艷山姜精油對基因表達的影響

3 結(jié)論

本研究利用水蒸氣蒸餾法，提取艷山姜精油，通過 GC-MS分析可知，精油組分主要包含烯烴類和醇類物質(zhì)，分別占揮發(fā)組分的 63.88%、19.52%。同時，利用人體肝癌細胞HepG2系，研究了艷山姜精油抑制腫瘤細胞增殖功效，通過CCK法分析精油對細胞增殖的影響，表明精油為200 μg/mL時，處理48 h后對細胞增殖的抑制率達到 56.8%。利用流式細胞術(shù)分析艷山姜精油對細胞凋亡的影響，200 μg/mL的精油處理24 h，細胞凋亡率較對照提高了2.5倍。利用QPCR分析精油處理后細胞凋亡相關(guān)基因表達，結(jié)果表明，促進細胞凋亡的基因Caspase-3、Caspase-9、p53表達量均提升，而促進細胞增殖的PCNA基因表達顯著降低。本研究表明艷山姜精油能抑制HepG2增殖，促進細胞凋亡，為開發(fā)艷山姜健康食品提供了科學(xué)支撐。