崔婷，李焐儀，文珊，胡懿，彭杰寶，程鈺潔，徐杰

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

益智為姜科植物益智Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于海南、廣東、廣西等地，為“四大南藥”之一，臨床常以除去雜質(zhì)及外殼后的飲片益智仁入藥，其性溫，味辛，歸脾、腎經(jīng)，有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效，主要用于腎虛遺尿、小便頻數(shù)、遺精白濁、脾寒泄瀉、腹中冷痛、口多唾涎等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，益智仁有保護(hù)神經(jīng)、鎮(zhèn)靜抗炎、抗癌等作用[2]。中藥物質(zhì)成分組成復(fù)雜多樣，以單一指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)存在一定局限性。益智仁主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、甾醇類、萜類及二苯基庚烷類等[3-6]，而《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（一部）益智仁含量測(cè)定項(xiàng)下僅規(guī)定了揮發(fā)油的限度，顯然不利于益智仁的質(zhì)量控制。中藥指紋圖譜是中藥整體性化學(xué)成分的表征，可以較為全面地反映中藥化學(xué)成分信息。熵權(quán)逼近理想解排序法（TOPSIS）可將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為一個(gè)綜合指標(biāo)，降低分析過程中不同類型指標(biāo)的干擾，也可避免人為賦權(quán)的主觀性，使分析結(jié)果更為客觀合理[7-8]。結(jié)合指紋圖譜與熵權(quán)TOPSIS對(duì)不同產(chǎn)地益智仁的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果更科學(xué)。同時(shí)，揮發(fā)油、浸出物、灰分、二氧化硫殘留量等也是影響益智仁質(zhì)量的重要因素。因此，本研究建立益智仁超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜，并結(jié)合揮發(fā)油、浸出物、灰分、二氧化硫殘留量等指標(biāo)，采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）和熵權(quán)TOPSIS 對(duì)不同產(chǎn)地益智仁的整體質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為益智仁質(zhì)量控制及產(chǎn)地適應(yīng)性研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-CLASS 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；ME204E 型萬(wàn)分之一天平、XP26 型百萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品原兒茶酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110809-201205，純度：99.9%）；圓柚酮對(duì)照品（深圳市麗景生物科技有限公司，批號(hào)：6-JTN-173-1，純度：100%）；色譜級(jí)甲醇、乙腈（默克股份有限公司）；色譜級(jí)磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

15 批益智仁均為自購(gòu)飲片，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為姜科植物益智Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果實(shí)除去雜質(zhì)及外殼后的飲片，樣品來(lái)源見表1。

表1 15批益智仁來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，8%～16%A；8～18 min，16%A；18～32 min，16%～25%A；32～35 min，25%～35%A；35～44 min，35%A；44～60 min，35%～73%A；60～62 min，73%～8%A；62～65 min，8%A）；流速：0.35 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、圓柚酮對(duì)照品適量，加甲醇制成原兒茶酸、圓柚酮質(zhì)量濃度分別為101.78、159.44 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取益智仁飲片粉末（過四號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：HNS-S1），按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以13 號(hào)圓柚酮色譜峰為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.15%，相對(duì)峰面積RSD＜0.43%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：HNS-S1），按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，以13 號(hào)圓柚酮色譜峰為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.12%，相對(duì)峰面積RSD＜0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取益智仁飲片粉末樣品（編號(hào)：HNS-S1）6 份，按2.1.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以13 號(hào)圓柚酮色譜峰為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.28%，相對(duì)峰面積RSD＜0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立及色譜峰指認(rèn) 取15 批益智仁飲片樣品，按2.1.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各特征峰峰面積，并進(jìn)行量化處理（峰面積/取樣量/60 000），結(jié)果見表2。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）對(duì)采集的色譜圖進(jìn)行處理，以HNS-S1樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，通過多點(diǎn)校正、全譜峰匹配生成共有指紋圖譜，同時(shí)采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜R，并建立益智仁飲片UPLC 指紋圖譜（圖1）。通過與混合對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出2個(gè)成分，分別為1號(hào)色譜峰（原兒茶酸）、13 號(hào)色譜峰（圓柚酮），對(duì)照?qǐng)D譜見圖2。

圖1 15批不同產(chǎn)地益智仁飲片共有峰特征圖譜

圖2 益智仁飲片對(duì)照指紋圖譜及混合對(duì)照品UPLC圖

表2 15批益智仁飲片量化后各特征峰相對(duì)峰面積

2.1.8 相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）分析軟件，以對(duì)照?qǐng)D譜R為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，益智仁不同批次間指紋圖譜基本相似，與對(duì)照?qǐng)D譜一致性較好，15批益智仁飲片相似度依次為0.999、1.000、0.998、1.000、0.999、0.999、1.000、0.992、0.986、0.996、0.996、0.997、0.997、0.996、0.996，相似度均大于0.980，符合指紋圖譜的研究要求。

2.2 揮發(fā)油量的測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020 年版（通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法）甲法[9]，對(duì)15 批益智仁中揮發(fā)油量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，15 批益智仁揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.1%～1.6%，均大于1.0%，符合《中國(guó)藥典》2020年版益智仁項(xiàng)下?lián)]發(fā)油的限度要求。

2.3 浸出物測(cè)定

按《中國(guó)藥典》 2020 年版（通則2201 浸出物測(cè)定法）熱浸法[9]，對(duì)15 批益智仁醇溶性浸出物、水溶性浸出物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，15 批益智仁醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.19%～8.07%，均值為6.50%；水溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.55%～18.17%，均值為17.01%。

表3 15批益智仁各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.4 二氧化硫殘留量測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020 年版（通則2331 二氧化硫殘留量測(cè)定法）第二法[9]，對(duì)15 批益智仁二氧化硫殘留量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，15 批益智仁二氧化硫殘留量為0～54 mg·kg-1，均小于150 mg·kg-1，符合《中國(guó)藥典》2020年版通則限度要求。

2.5 灰分測(cè)定

2.5.1 總灰分測(cè)定 按《中國(guó)藥典》2020 年版（通則2302灰分測(cè)定法）總灰分測(cè)定法[9]，對(duì)15批益智仁總灰分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，15批益智仁總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.2%～8.5%，均小于8.5%，符合《中國(guó)藥典》2020年版益智項(xiàng)下總灰分的限度要求。

2.5.2 酸不溶性灰分測(cè)定 按《中國(guó)藥典》2020年版（通則2302 灰分測(cè)定法）酸不溶性灰分測(cè)定法[9]，對(duì)15 批益智仁酸不溶性灰分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，15 批益智仁酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～1.5%，均小于1.5%，符合《中國(guó)藥典》2020年版益智項(xiàng)下酸不溶性灰分的限度要求。

2.6 OPLS-DA

以15 批益智仁飲片揮發(fā)油量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量及15 個(gè)特征峰峰面積量化值為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行OPLS-DA，得分見圖3，不同產(chǎn)地益智仁飲片呈現(xiàn)一定分類聚集現(xiàn)象。OPLS-DA模型中變量重要性投影（VIP）值見圖4，VIP 值越大，即變量離X軸越遠(yuǎn)，表明該指標(biāo)對(duì)區(qū)分不同產(chǎn)地益智仁的貢獻(xiàn)越大，可能是區(qū)分不同產(chǎn)地益智仁的差異性成分。VIP 值＞1.0 的指標(biāo)分別為峰13（原柚酮，2.670）、二氧化硫殘留量（1.808）、峰4（1.513）、峰14（1.485）、峰11（1.258），說(shuō)明以上指標(biāo)對(duì)不同產(chǎn)地益智仁的分類影響顯著。

圖3 15批益智仁飲片OPLS-DA得分

圖4 15批益智仁飲片各指標(biāo)VIP分析（±s, n=15）

2.7 熵權(quán)TOPSIS分析

2.7.1 歸一化法處理 由于益智仁各指標(biāo)成分存在量綱不一致的問題，因此需要根據(jù)公式（1）、（2）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行同向歸一化處理，建立標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣[7-8]。峰1～15（峰1為原兒茶酸）、揮發(fā)油量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物為越大越優(yōu)型指標(biāo)，采用公式（1）計(jì)算，總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量為越小越優(yōu)型指標(biāo)；采用公式（2）計(jì)算，各指標(biāo)歸一化處理結(jié)果見表4。

表4 益智仁飲片各指標(biāo)同向歸一化處理結(jié)果

式中Rij代表不同指標(biāo)類型，在公式（1）中為越大越優(yōu)型指標(biāo)，在公式（2）中為越小越優(yōu)型指標(biāo)，Xij代表樣本值i=（1，2，……，m）；指標(biāo)值j=（1，2，……，n）所形成的多目標(biāo)決策矩陣為Xij。

2.7.2 各指標(biāo)成分權(quán)重的確定 熵權(quán)法是基于評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵大小與差異離散程度，指標(biāo)數(shù)據(jù)離散程度越高熵值就越小，說(shuō)明該指標(biāo)提供的有效信息量就越大，對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響就越大。熵值法計(jì)算指標(biāo)權(quán)重，可以決定各指標(biāo)在樣品評(píng)價(jià)過程中的重要性，客觀地評(píng)價(jià)各個(gè)指標(biāo)，排除主觀因素的影響[7-8]，按公式（3）、（4）計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重（wj），分別 為0.060、0.124、0.061、0.075、0.037、0.049、0.051、0.046、0.038、0.022、0.054、0.042、0.061、0.074、0.042、0.028、0.018、0.014、0.056、0.036、0.012。

式中Ej指第j項(xiàng)指標(biāo)的熵值，wj指第j項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重。

2.7.3 最優(yōu)與最劣方案的確定 將歸一化后數(shù)據(jù)與各指標(biāo)的權(quán)重進(jìn)行相乘，得加權(quán)決策矩陣Z[7-8]。根據(jù)加權(quán)矩陣結(jié)果得到最優(yōu)方案Z+=max（Z1，Z2，......Zm）；最劣方案Z-=min（Z1，Z2，......Zm）。

2.7.4 貼近度的計(jì)算及評(píng)價(jià) 根據(jù)最優(yōu)與最劣方案，按公式（5）計(jì)算15 批益智仁樣品與Z+和Z-的距離D+和D-，并根據(jù)距離D+和D-，按公式（6）計(jì)算評(píng)價(jià)對(duì)象與Z+的貼近度Ci[7-8]，并根據(jù)Ci的大小對(duì)評(píng)價(jià)對(duì)象進(jìn)行排名。Ci在［0，1］內(nèi)，越大表示該評(píng)價(jià)對(duì)象越好，反之，越差，見表5。

2.7.5 熵權(quán)TOPSIS 分析結(jié)果 本研究中的指標(biāo)，以各特征峰峰面積、揮發(fā)油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量為高優(yōu)型指標(biāo)，總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量為低優(yōu)型指標(biāo)，由表5 可知，海南省瓊中縣（HNS-S1～S3）、海南省屯昌縣（HNS-S4～S6）、海南省萬(wàn)寧市（HNS-S7～S9）、廣東省陽(yáng)春市（GDS-S10～S12）、廣東省高州市（GDSS13～S15）平 均Ci分別為0.520、0.378、0.577、0.206、0.207，表明海南產(chǎn)益智仁綜合質(zhì)量整體優(yōu)于廣東省，且以海南省萬(wàn)寧市質(zhì)量最優(yōu)，可作為優(yōu)良種質(zhì)資源進(jìn)一步研究與開發(fā)。

表5 15批益智仁飲片質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

本研究分別比較了不同柱溫（25、30、35 ℃）及流速（0.25、0.30、0.35 mL·min-1）條件下的指紋圖譜，結(jié)果表明柱溫為30 ℃，流速為0.35 mL·min-1時(shí)，樣品分離度較好，峰形較對(duì)稱，能夠滿足分析要求。同時(shí)以指紋圖譜峰峰形、分離度及共有峰總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察了不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇）及提取時(shí)間（15、30、45 min），結(jié)果表明，以70%甲醇為溶劑提取30 min時(shí)得到的峰形及分離度較好，共有峰總峰面積較大。

本研究建立了益智仁UPLC指紋圖譜，標(biāo)定了15個(gè)共有峰，并對(duì)15批益智仁飲片的15個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)測(cè)定了15批飲片的揮發(fā)油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量、二氧化硫殘留量、總灰分和酸不溶性灰分。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地益智仁指紋圖譜共有峰總峰面積均值排序?yàn)楹Ｄ鲜…傊锌h＞海南省萬(wàn)寧市＞海南省屯昌縣＞廣東省陽(yáng)春市＞廣東省高州市；揮發(fā)油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量、總灰分、酸不溶性灰分整體差異不大，海南省瓊中縣產(chǎn)益智仁二氧化硫殘留量明顯低于其他產(chǎn)區(qū)。

本研究采用OPLS-DA 分析各產(chǎn)地益智仁的質(zhì)量差異，篩選影響益智仁質(zhì)量的主要指標(biāo)，峰13、峰4、峰14、峰11 的峰面積及二氧化硫殘留量可作為區(qū)分不同產(chǎn)地益智仁的主要指標(biāo)；同時(shí)參照熵權(quán)TOPSIS 在中藥質(zhì)量分析中的應(yīng)用，建立益智仁飲片整體質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，對(duì)15 批益智仁進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，5 個(gè)不同產(chǎn)地益智仁樣品的Ci排序?yàn)楹Ｄ鲜∪f(wàn)寧市＞海南省瓊中縣＞海南省屯昌縣＞廣東省高州市＞廣東省陽(yáng)春市，與各指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致。

本研究采用熵權(quán)TOPSIS對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行客觀權(quán)重賦值，排除了主觀賦值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與科學(xué)性，實(shí)現(xiàn)對(duì)益智仁整體質(zhì)量的控制。該方法相對(duì)于傳統(tǒng)中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，結(jié)果更為科學(xué)、客觀，可應(yīng)用于對(duì)不同產(chǎn)地益智藥材及其他中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)及種質(zhì)篩選。