李柯翱，米爾扎提·麥麥提，張明惠，劉婷，蘇海娣，馬璇*

1.新疆奇沐醫(yī)藥研究院（有限公司），新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥品審評查驗(yàn)中心，新疆 烏魯木齊 830011

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-300DB 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AE-100 型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110831-200302、100080-200306、111610-201607、110731-201619，純度分別為91.5%、91.7%、93.1%和96.2%）；乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

寒喘祖帕顆粒（新奇康藥業(yè)股份有限公司，編號為S1～S12，批號分別為170860、170851、170931、170849、170862、170853、170863、170932、170861、170864、170956、170957）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸、甘草酸銨、甘草苷、蘆丁對照品適量，用甲醇溶解，稀釋成沒食子酸、甘草苷、甘草酸銨、蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.04、0.04、0.07、0.03 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱量寒喘祖帕顆粒3.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞后稱定錐形瓶質(zhì)量，超聲30 min 后取出置于試驗(yàn)臺，靜置至室溫后稱質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，得續(xù)濾液，即得。

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件

Kromasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～30 min，15%～30%A；30～45 min，30%～40%A；45～60 min，40%～60%A；60～70 min，60%～64%A）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

公司各級管理人員變動頻繁，給“校企一體”教學(xué)模式的實(shí)施帶來一定困難，新到崗的經(jīng)理、主管在一段時(shí)間后才能熟悉這種培養(yǎng)方式，所以實(shí)施過程中會出現(xiàn)一定時(shí)期的斷層。這種培養(yǎng)模式使校、企、學(xué)三方受益，公司人事變動對實(shí)施過程影響是暫時(shí)的，經(jīng)過校企雙方努力，使“校企一體”教學(xué)模式得以順利實(shí)施。

2.2.2 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：稱取寒喘祖帕顆粒1 份按2.1.2 項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，根據(jù)6 次測定結(jié)果，得到對應(yīng)的色譜圖。在對應(yīng)色譜圖中標(biāo)示出所有共有峰，以甘草酸銨作為參照峰，計(jì)算圖譜中各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，RSD 均小于2%，表明儀器精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批次的寒喘祖帕顆粒6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，6 份供試品溶液分別進(jìn)樣，得到對應(yīng)的色譜圖。在對應(yīng)色譜圖中標(biāo)出所有共有峰，以甘草酸銨為參照峰，以甘草酸銨的出峰時(shí)間及峰面積為1，計(jì)算圖譜中各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取寒喘祖帕顆粒1 份，按2.1.2 項(xiàng)下方法制成進(jìn)樣供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，得到對應(yīng)的色譜圖。在對應(yīng)色譜圖中標(biāo)示出所有共有峰，以甘草酸銨為參照峰，以甘草酸銨的出峰時(shí)間及峰面積為1，計(jì)算圖譜中各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，RSD 均小于3%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 共有峰的建立及鑒別 按2.1.2 項(xiàng)下方法精密稱取12 批寒喘祖帕顆粒樣品，制成供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件對各批供試品溶液進(jìn)行測定，將所得的HPLC 色譜圖進(jìn)行疊加、分析、對比。進(jìn)一步確定寒喘祖帕顆粒指紋圖譜的共有模式圖，進(jìn)行共有峰的標(biāo)記。按2.1 項(xiàng)下方法制備對照品溶液，進(jìn)樣得到對應(yīng)的對照品溶液色譜圖，將其與供試品溶液色譜圖進(jìn)行比對，根據(jù)保留時(shí)間確定共有峰，從光譜圖中再分析確定各色譜峰的最大吸收波長。本研究采用對照品對比法共計(jì)標(biāo)示出4 個(gè)色譜峰，分別為沒食子酸，蘆丁、甘草苷、甘草酸銨。該指紋圖譜中有15 個(gè)峰（圖1）；混合對照品圖譜中1、5、7、13 號峰分別為沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨（圖2）；12 批寒喘祖帕顆粒樣品HPLC 疊加圖見圖3。

圖1 寒喘祖帕顆粒HPLC指紋圖譜共有模式圖

圖2 沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液的HPLC圖

圖3 12批寒喘祖帕顆粒的HPLC圖

2.2.4 相似度結(jié)果分析 將上述經(jīng)HPLC 分析測定的12 批寒喘祖帕顆粒樣品得到的不同色譜圖導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件進(jìn)行分析。在分析時(shí)，把其中1 批寒喘祖帕顆粒（批號：170853）的圖譜數(shù)據(jù)作為參照圖譜，按系統(tǒng)操作，采用平均數(shù)法生成對照指紋圖譜R，再進(jìn)行12批寒喘祖帕顆粒色譜圖的相關(guān)分析，獲得12批寒喘祖帕顆粒樣品HPLC 指紋圖譜相似度結(jié)果，相似度為0.907～0.997（表1）。由表1可知，寒喘祖帕顆粒各批次間質(zhì)量相對穩(wěn)定，產(chǎn)品安全性較好。

表1 12批寒喘祖帕顆粒的相似度結(jié)果

2.2.5 樣品含量測定

2.2.5.1 線性關(guān)系考察 按2.1 項(xiàng)下方法制成沒食子酸、甘草苷、蘆丁、甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.16、0.16、0.16、0.40 mg·mL-1的混合對照品溶液，使用倍比稀釋法，加甲醇分別稀釋2、4、8、16、32倍，得6份質(zhì)量濃度不同的混合對照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄待測成分的色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果顯示，沒食子酸、蘆丁、甘草苷和甘草酸銨在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 沒食子酸、甘草苷、蘆丁、甘草酸銨的線性關(guān)系

2.2.5.2 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：稱取寒喘祖帕顆粒樣品1 份，按2.1.2 項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為1.6%、1.8%、1.7%和1.6%。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批的寒喘祖帕顆粒樣品6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨含量的RSD分別為1.8%、2.4%、2.5%和1.4%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取寒喘祖帕顆粒樣品1 份，按2.1.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為1.9%、2.2%、2.1%和1.5%。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的同一批寒喘祖帕顆粒6份，按2.1項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨平均加樣回收率分別為96.26%、96.13%、95.87%和97.65%，RSD分別為1.9%、2.1%、2.3%和1.8%。

2.2.5.3 含測測定 取12批寒喘祖帕顆粒，按2.2.1項(xiàng)下條件下測定，計(jì)算4個(gè)成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 寒喘祖帕顆粒中4個(gè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)mg·g-1

2.3 化學(xué)模式識別分析

2.3.1 聚類分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對12批寒喘祖帕顆粒色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以歐式距離評分作為測量度，進(jìn)行12批寒喘祖帕顆粒樣品系統(tǒng)聚類分析（圖4）。結(jié)果顯示，12 批寒喘祖帕顆粒大致分為3類，Ⅰ類包括S1～S2、S5～S12，Ⅱ類包括S4，Ⅲ類包括S3。聚類分析中聚為一類的表示相似性較好。

圖4 12批寒喘祖帕顆粒的聚類分析結(jié)果

2.3.2 主成分分析（PCA）采用SPSS 23.0 先對圖譜中各個(gè)共有峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后對12批寒喘祖帕顆粒樣品的15 個(gè)共有峰進(jìn)行PCA，得出相關(guān)PCA 特征性及方差貢獻(xiàn)率。前2 個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為80.675%，且特征根均大于1，提示這2個(gè)主成分能夠代表共有峰的大部分信息。從圖5可以看出，前2 個(gè)因子處在較為陡峭的斜率位置上，第3個(gè)因子斜率開始變得較為平緩，因此，選擇2個(gè)主成分因子進(jìn)行分析。主成分載荷矩陣見表4，其反映了各變量對主成分的貢獻(xiàn)程度，主成分1 主要反映了4、6、7、8、10、11、13、14 號峰有較高的載荷值，7 號峰為甘草苷，13 號峰為甘草酸銨；主成分2 主要反映了3、5、9、12 號峰的信息，5 號峰為蘆丁。通過成分得分系數(shù)矩陣計(jì)算綜合得分，可以評價(jià)不同批號的整體質(zhì)量，得分及排名見表5。

表4 寒喘祖帕顆粒樣品色譜峰主成分載荷矩陣

表5 12批寒喘祖帕顆粒主成分得分、綜合得分及排名

圖5 寒喘祖帕顆粒指紋圖譜PCA特征值的碎石圖

2.3.3 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）將12 批寒喘祖帕顆粒樣品共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14軟件進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果見圖6。OPLSDA模型得分圖顯示，寒喘祖帕顆粒樣品可很好地聚類為3類，與聚類分析、PCA結(jié)果一致。以模型變量重要性投影（VIP）值為指標(biāo)，將能夠引起組間差異的成分進(jìn)行分析，VIP圖可反映出每個(gè)峰的貢獻(xiàn)程度。VIP值＞1的色譜峰分別為13號峰（1.960 36）、6號峰（1.796 61）、1號峰（1.227 13）、7號峰（1.132 76），是引起寒喘祖帕顆粒批次間差異的主要標(biāo)志性成分，其是區(qū)分樣品最關(guān)鍵的色譜峰，對樣品分類作用較大，見圖7。

圖6 12批寒喘祖帕顆粒樣品的OPLS-DA得分圖

圖7 寒喘祖帕顆粒樣品的VIP值結(jié)果（±s, n=12）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

寒喘祖帕顆粒中所含化學(xué)成分較多，性質(zhì)也各不相同，為在色譜圖中更多地體現(xiàn)藥材中含有的化學(xué)成分信息[4,19]。本研究通過查閱大量文獻(xiàn)，最終選擇了以水與50%甲醇作為溶劑，用這2 種溶劑對樣品進(jìn)行提取，得到供試品溶液。進(jìn)樣結(jié)果的色譜圖可看出，50%甲醇和水分別為溶劑時(shí)，在同樣的色譜條件下所得的HPLC 圖基本一致，而以水提取的樣品不易保存且不易過濾，綜合考慮，最終選擇50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

本研究采用二極管陣列檢測器，在相同色譜條件下，在波長190～800 nm 下進(jìn)行掃描。分別選擇了200、220、254、273、330、365 nm 波長下的色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)各個(gè)波長下呈現(xiàn)出的3D圖譜和對應(yīng)的波長下的平面色譜圖，可以看出在220 nm 波長條件下所獲得的供試品溶液的圖譜能夠顯示更豐富的信息，且各色譜峰的分離效果也較好，故選擇220 nm作為測定波長。

3.3 色譜條件的選擇

考察了甲醇和乙腈作為流動相時(shí)不同梯度和等度對寒喘祖帕顆粒指紋圖譜的影響。在等度分析甲醇與乙腈為流動相時(shí)，分離度均較差，為了使各色譜峰有較好的分離效果，選擇梯度洗脫。通過對供試品液相圖譜的對比，乙腈作為流動相時(shí)比甲醇作為流動相得到的色譜圖出峰要多，而且通過對比這2 種流動相得到的不同圖譜，發(fā)現(xiàn)在各色譜峰之間的分離度方面乙腈優(yōu)于甲醇，故最終選擇乙腈作為該研究的流動相。

3.4 分析方法評價(jià)

本研究建立了寒喘祖帕顆粒的HPLC 指紋圖譜，確定了15 個(gè)共有峰，并對12 批樣品進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，寒喘祖帕顆粒的HPLC 色譜指紋圖譜具有良好的相似性。此外，本研究通過化學(xué)模式識別分析建立了聚類分析、PCA、OPLS-DA 分類模型，這3 種分析方法的結(jié)果基本一致。12 批樣品通過聚類分析被分為3類；PCA得到前2個(gè)成分因子累積方差貢獻(xiàn)率可達(dá)80.675%，第1 主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率達(dá)到64.524%，主要反映了以甘草中代表性成分甘草苷、甘草酸銨為主的化學(xué)成分在質(zhì)量控制中發(fā)揮了主要作用；OPLS-DA 以共有峰VIP 值＞1色譜峰為1、6、7、13 號峰，可能是區(qū)分樣品的關(guān)鍵色譜峰。其中，1 號峰為沒食子酸、7 號峰為甘草苷、13 號峰為甘草酸銨，上述3 種成分是寒喘祖帕顆粒中的活性成分，對寒喘祖帕顆粒的質(zhì)量控制起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究建立的HPLC 指紋圖譜方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，并建立化學(xué)模式識別分析方法，可為寒喘祖帕顆粒的質(zhì)量評價(jià)與控制提供參考。