寧德正， 莊可卿， 張巧玲， 李 華， 張婉桐 ，張桁源 ， 胡頌平, 3)*， 衛(wèi)海濱

(1)上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心， 上海 201106；2)江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與生物工程學(xué)院植物功能基因與組織培養(yǎng)技術(shù)研究中心，南昌 330045；3)江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生理生態(tài)與江西農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南昌 330045)

RNA修飾是一種全新的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控方式[1]，已成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域繼DNA甲基化和組蛋白修飾后的一個(gè)研究熱點(diǎn)。m6A是位于第6號(hào)位N上發(fā)生甲基化的腺苷，是真核生物mRNA最常見(jiàn)的一種分子修飾[2]，具有可逆性和動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)。通過(guò)Writers、Erasers和Readers形成m6A甲基化酶復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)甲基化或去甲基化修飾過(guò)程。閱讀器蛋白R(shí)eaders作為m6A結(jié)合蛋白，特異性識(shí)別并結(jié)合RNA上的m6A位點(diǎn)，進(jìn)而參與各種生物學(xué)功能，包括mRNA前剪接、mRNA降解、翻譯效率和翻譯起始模式等[3]。m6A Readers蛋白首先在哺乳動(dòng)物細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)包含1個(gè)YTH (YT521-B homology) 結(jié)構(gòu)域[4]，在人類(lèi)中分別命名為：YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3[5]。YTH家族成員高度保守，包含1個(gè)芳香族氨基酸殘基形成的籠袋，用于識(shí)別m6A修飾的堿基，這些蛋白質(zhì)廣泛存在動(dòng)植物中，植物中尤為豐富[6]。植物擬南芥的YTH結(jié)構(gòu)域通常被命名為ECT結(jié)構(gòu)域 (evolutionarily conserved C-terminal region)[7]，擬南芥ECT蛋白基本歸屬YTHDF亞家族，只有AtCPSF30、AtECT12被認(rèn)為是YTHDC亞家族[3, 8, 9]。ECT2為擬南芥中首個(gè)實(shí)驗(yàn)鑒定的ECT蛋白，可調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育[10]；而在熱脅迫下，ECT2參與抑制mRNA翻譯起始，重新定位至應(yīng)激顆粒，表明ECT2能控制被結(jié)合的mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的狀態(tài)，從而響應(yīng)逆境脅迫[11]。ECT2、ECT3和ECT4研究中發(fā)現(xiàn)，這些ECT蛋白可以調(diào)控?cái)M南芥葉片發(fā)育起始時(shí)間和形狀[3]。ECT家族蛋白的功能研究對(duì)于探索m6A甲基化修飾的分子調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要，但水稻ECT蛋白的研究較少。ECT基因家族可能在單、雙子葉植物演化中經(jīng)歷的基因組事件不同，因此，水稻ECT基因家族的全基因組研究有待深入分析。

水稻作為世界重要的糧食作物之一，其生產(chǎn)卻受到各種非生物脅迫的影響。缺水灌溉，土壤貧瘠，旱災(zāi)頻繁，限制了水稻產(chǎn)量的突破。培育高效優(yōu)質(zhì)、資源節(jié)約、環(huán)境友好型的節(jié)水抗旱稻是解決水稻種植困境的有效途徑。抗旱的分子機(jī)制較為復(fù)雜，涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯和修飾等多個(gè)層面。轉(zhuǎn)錄后m6A甲基化修飾參與各種非生物和生物脅迫響應(yīng)，ECT蛋白特異性識(shí)別脅迫響應(yīng)基因，ECT基因家族的全基因組分析將為水稻的抗旱分子調(diào)控機(jī)制提供新的理論支持。

隨著各個(gè)植物全基因組測(cè)序相繼完成，為進(jìn)一步分析ECT基因提供了有利條件。本研究通過(guò)對(duì)水稻基因組中ECT基因的鑒定，并分析基序組成、染色體分布、保守基序、系統(tǒng)發(fā)育、基因組共線(xiàn)性和表達(dá)模式等，為水稻ECT基因家族的特征及功能研究提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻ECT基因家族成員鑒定

首先獲取ECT基因家族共有的YTH結(jié)構(gòu)域在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù) (http://pfam.xfam.org) 中的索取號(hào)(PF04146) ，下載隱馬爾科夫模型文件。然后，使用HMMER3.0對(duì)水稻日本晴參考基因組的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行ECT蛋白預(yù)測(cè)。過(guò)濾去除E-value小于0.05且序列長(zhǎng)度小于200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步利用SMART[12, 13](http://smart.embl-heidelberg.de/) 檢測(cè)YTH結(jié)構(gòu)域的存在。最后，獲得12個(gè)水稻ETC基因，并利用國(guó)家水稻數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站 (http://www.ricedata.cn/gene/) ，獲取蛋白質(zhì)分子量與等電點(diǎn)等信息。

1.2 水稻ECT基因結(jié)構(gòu)分析與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用NCBI網(wǎng)站的CDD (The Conserved Domain Database) 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取ECT蛋白結(jié)構(gòu)域信息，并使用Tbtools[14](https://github.com/CJ-Chen/TBtools) 軟件進(jìn)行基因保守結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)示意圖繪制。利用水稻ETC基因家族的氨基酸序列，使用ClustalW默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行多序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果文件導(dǎo)入MEGA-X軟件，使用鄰接法 (neighbor joining，NJ) 對(duì)ECT蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)抽樣檢驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。使用在線(xiàn)工具iTOL (https://itol.embl.de/) 對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化。

1.3 水稻ECT基因重復(fù)及共線(xiàn)性分析

使用MCScanX軟件默認(rèn)參數(shù)分析水稻ECT基因的復(fù)制事件，并分析水稻與擬南芥及玉米之間的基因同源性。利用TBtools軟件繪制水稻基因組內(nèi)和物種間共線(xiàn)性比較關(guān)系圖譜。使用整合工具ParaAT[15]，提取多個(gè)ECT基因CDS序列，利用KaKs_Calculator2.0[16]計(jì)算其非同義 (Ka) 和同義 (Ks) 替換。

1.4 水稻ECT基因家族的表達(dá)分析

水稻基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)源于公共數(shù)據(jù)庫(kù)MBKbase (http://www.mbkbase.org/) ，查詢(xún)?cè)搸?kù)1 750多份RNA-Seq數(shù)據(jù)，挑選根、芽、葉3個(gè)組織2個(gè)時(shí)間點(diǎn) (7 d和14 d) 的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。干旱脅迫的RNA-Seq數(shù)據(jù)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室的旱優(yōu)73 (HY73) 桶栽實(shí)驗(yàn)，水稻生長(zhǎng)至30 d時(shí)進(jìn)行苗期干旱脅迫7 d。使用htseq-count軟件[17]獲取每個(gè)樣本中比對(duì)到ECT基因上的reads數(shù)，根據(jù)FPKM計(jì)算公式計(jì)算基因的FPKM值。

2 結(jié)果

2.1 水稻ECT基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

通過(guò)HMMER軟件對(duì)水稻日本晴參考基因組的全蛋白質(zhì)序列搜索，鑒定ECT基因的YTH蛋白核心結(jié)構(gòu)域，篩選過(guò)濾冗余序列和無(wú)完整讀碼框序列，最終獲得12個(gè)水稻ECT基因 (Table 1) 。根據(jù)在染色體上的位置以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將其命名為OsECTa-OsECTl。并分析水稻OsECT基因理化性質(zhì)，包括蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、染色體位置、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)等基因特征 (Table 1) 。其氨基酸序列的長(zhǎng)度較為接近，OsECT-j是最短的OsECT蛋白 (578個(gè)氨基酸) ，而最長(zhǎng)的是OsECT-d蛋白 (710個(gè)氨基酸) 。該類(lèi)蛋白質(zhì)分子量范圍為63 792.73 (OsECT-g) ～ 78 204.96 (OsECT-a) 。OsECT蛋白理論等電點(diǎn)pI范圍為4.93 (OsECT-k) ～ 8.69 (OsECT-a) 。

Table 1 Physical and chemical characteristics of the ECT gene family in Oryza sativa

2.2 水稻ECT基因家族結(jié)構(gòu)及進(jìn)化樹(shù)分析

利用水稻和擬南芥的ECT蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如Fig.1A所示。YTH結(jié)構(gòu)域位于肽段C-端，在2個(gè)物種中均高度保守。但擬南芥AtCPSF30和水稻OsECT-l另含有1個(gè)YTH1超家族結(jié)構(gòu)域，水稻OsECT-c另含有1個(gè)PHA02732超家族結(jié)構(gòu)域，目前功能未知。水稻OsECT-l 另含有1個(gè)Cytadhesin P30超家族結(jié)構(gòu)域，未發(fā)現(xiàn)與RNA修飾相關(guān) (Fig.1B) 。這表明，在水稻和擬南芥的ECT蛋白形成過(guò)程中可能發(fā)生過(guò)不同的進(jìn)化事件。

Fig.1 Multiple sequence alignment and protein motif compositions of the ECT gene family in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana (A) The amino acid sequence alignment results of 25 ECT proteins in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana，and the amino acid sequence of the C-terminal ECT domain was selected for display. The red box indicates the YTH domain. (B) Visualization of the conserved domains of 25 ECT proteins in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana. The conserved domain was annotated from NCBI’s CDD (the Conserved Domain Database) and visualized in TBtools

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，ECT蛋白家族可以分為5組，水稻ECT成員在5組中均有分布 (Fig.2)。根據(jù)哺乳動(dòng)物中的劃分，將YTH家族成員分為YTHDF亞家族和YTHDC亞家族，其中YTHDC亞家族含有1個(gè)水稻ECT蛋白 (OsECT-l) 和2個(gè)擬南芥ECT蛋白 (AtECT12和AtCPSF30) 。而AtCPSF30與OsECT-l親緣關(guān)系接近，且均具有YTH1超家族結(jié)構(gòu)域，推測(cè)它們功能相近。YTHDF亞家族則包含其它4個(gè)進(jìn)化分支的ECT蛋白，包括 (OsECTa ～ k) 。哺乳動(dòng)物中YTHDF均定位于細(xì)胞質(zhì)，功能存在冗余[18]。同樣，在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)YTHDF家族之間功能冗余，例如AtECT2、AtECT3、AtECT4共同調(diào)控葉片發(fā)育。本文的結(jié)果中，OsECT-c、OsECT-e、OsECT-i與已報(bào)道最多的擬南芥AtECT2親緣關(guān)系最接近，推測(cè)它們同樣具有調(diào)控葉片發(fā)育的功能。

Fig.2 Phylogenetic analysis of the ECT gene family in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana The phylogenetic tree of ECT proteins was constructed by the neighbor-joining method using the Mega-X program. The nodes are labeled in black squares and red triangles to represent the source of ECT genes from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa. The ECT protein family was divided into five groups and displayed by the online tool iTOL

2.3 水稻ECT基因重復(fù)事件和共線(xiàn)性分析

水稻12個(gè)OsECT基因不均勻分布在7條染色體中，且多分布于染色體兩端 (Fig.3) 。其中，5、6、7號(hào)染色體均含1個(gè)OsECT基因，1、4、8號(hào)染色體均含2個(gè)OsECT基因，3號(hào)染色體含3個(gè)OsECT基因。物種內(nèi)共線(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn)，3號(hào)染色體上存在1個(gè)片段重復(fù)事件 (segmental duplication event) ，基因OsECT-c和OsECT-e為1對(duì)片段重復(fù)基因，可能是一個(gè)祖先基因復(fù)制后重組于同一條染色體內(nèi)。

Fig.3 The chromosome distribution and synteny analysis of ECT genes in Oryza sativa The modes of ECT gene duplication were detected in rice genome using MCScanX. Grey lines represent all collinear modules in the rice genome，and red lines represent duplicate ECT gene pairs. The chromosome number is shown in the middle of each chromosome

為了進(jìn)一步推斷水稻ECT家族的系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制，構(gòu)建了水稻與雙子葉擬南芥、水稻與單子葉玉米的基因共線(xiàn)性比較圖譜 (Fig.4) 。在擬南芥中，并未發(fā)現(xiàn)水稻OsECT基因的共線(xiàn)性直系同源基因。這與前人文獻(xiàn)中小麥與擬南芥的研究結(jié)果類(lèi)似[8]。在玉米中發(fā)現(xiàn)8個(gè)水稻基因的共線(xiàn)性關(guān)系，包括OsECT-b、OsECT-c、OsECT-e、OsECT-g、OsECT-i、OsECT-j、OsECT-k和OsECT-l。其中，OsECT-e(LOC_Os03g53670)、OsECT-g(LOC_Os04g51940 ) 與3個(gè)玉米ECT基因形成同源基因?qū)?，推測(cè)這些基因在水稻ECT家族進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。OsECT僅與玉米形成直系同源基因?qū)?，表明ECT基因可能在單、雙子葉植物分化后形成。

Fig.4 Synteny analysis of ECT genes between Oryza sativa and Arabidopsis thaliana, Zea mays Grey lines in the background represent collinear modules in rice and other plant genomes，while orange lines highlight the syntenic ECT gene pairs

為了判斷ECT基因家族受到的選擇壓力，本文計(jì)算了水稻OsECT片段重復(fù)基因?qū)陀衩字毕低碋CT基因?qū)Φ腒a/Ks值，觀察到所有ECT基因?qū)a/Ks均小于1 (OsECT-c與OsECT-e基因?qū)Φ腒a/Ks值為0.108116，玉米直系同源ECT基因?qū)a/Ks平均值為0.202268) 。這表明，水稻ECT基因家族在進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇壓力。

2.4 水稻ECT基因表達(dá)模式

來(lái)源于MBKbase數(shù)據(jù)庫(kù)的3個(gè)水稻組織 (根、芽、葉) 正常條件和本實(shí)驗(yàn)室干旱脅迫的RNA-Seq數(shù)據(jù)，調(diào)查水稻ECT基因的表達(dá)模式 (Fig.5) 。至少有9個(gè)OsECT基因高度表達(dá)。其中，OsECT-b、OsECT-c、OsECT-e、OsECT-j在3個(gè)組織中表達(dá)量一直保持較高的趨勢(shì)。表明這幾個(gè)基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用。OsECT-c(LOC_Os03g06240 ) 在12個(gè)基因中表達(dá)量最高；OsECT-e(LOC_Os03g53670 ) 隨著植物的生長(zhǎng)在葉片組織中表達(dá)上調(diào)程度最大，表明OsECT-e基因在葉片早期發(fā)育中可能有著重要作用；OsECT-i(LOC_Os07g07490 ) 在3個(gè)水稻組織中，隨著植物的生長(zhǎng)，表達(dá)量均明顯上調(diào)，表明OsECT-i基因在植物組織特定的生長(zhǎng)階段發(fā)揮作用。干旱脅迫處理后，OsECT-g(LOC_Os04g51940 ) 轉(zhuǎn)錄水平顯著性下調(diào) (log2FC = -1.00，F(xiàn)C = Fold Change) ，表明OsECT-g基因響應(yīng)干旱脅迫，在水稻抗旱過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

Fig.5 Expression profiles of ECT genes in Oryza sativa The quantity of gene expression were from multiple RNA-seq datasets in MBKbase and our laboratory. Blue and red colors indicate low and high expression，respectively，while black cells indicate much higher expression. The OsECT-b，OsECT-c，OsECT-e，OsECT-g，OsECT-i，and OsECT-j showed high expression in the root，shoot and leaf，under normal and drought conditions. HY73-leaf-WW and HY73-leaf-DT represent leaf tissues of Hanyou 73 under the well-watered and drought-treatment conditions, respectively

3 討論

RNA甲基化作為近年的研究熱點(diǎn)，為生物學(xué)問(wèn)題提供了新的觀察角度。ECT蛋白已被證明在模式植物擬南芥m6A甲基化的特異識(shí)別結(jié)合mRNA過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，水稻ECT基因家族結(jié)構(gòu)和進(jìn)化還缺乏研究。本研究通過(guò)鑒定和分析獲得了初步研究結(jié)果。

水稻基因組共鑒定出12個(gè)不均勻分布于7條染色體內(nèi)的OsECT基因。保守結(jié)構(gòu)域普遍位于C-端，而此結(jié)果與人類(lèi)m6A結(jié)合蛋白YTHDF2特性一致[19]，表明水稻OsECT基因具有類(lèi)似結(jié)合m6A并影響mRNA穩(wěn)定性的功能。擬南芥AtECT2也被證實(shí)在維持mRNA穩(wěn)定上發(fā)揮重要作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，水稻和擬南芥的全部ECT蛋白可被分為5組，每組都含有AtECT和OsECT，表明ECT蛋白具有高度保守的特點(diǎn)。玉米與水稻形成多個(gè)直系同源基因?qū)?，而擬南芥未見(jiàn)與水稻形成直系同源基因?qū)?，這表明水稻ECT與玉米可能具有更近的親緣關(guān)系。水稻和玉米同為單子葉植物，而擬南芥為雙子葉植物，推測(cè)擬南芥ECT基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷的選擇不同。水稻基因組內(nèi)ECT基因有一組基因?qū)?，這可能是由于基因復(fù)制產(chǎn)生的。因?yàn)閮苫蛳喔舸笥?00 kb，所以不屬于串聯(lián)重復(fù)事件[20]，而片段重復(fù)事件可能是OsECT進(jìn)化主要驅(qū)動(dòng)力之一。全基因組復(fù)制事件在植物進(jìn)化過(guò)程中很常見(jiàn)，是一種同源基因擴(kuò)張的主要原因[21]。目前，在擬南芥中被報(bào)道功能最多的屬AtECT2基因。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，與AtECT2蛋白親緣關(guān)系最緊密的為OsECT-c、OsECT-e、OsECT-i，而編碼它們的基因在水稻組織中的平均表達(dá)水平較高。這些OsECT基因可能在水稻早期發(fā)育中發(fā)揮著類(lèi)似AtECT2的功能，同樣可能影響mRNA穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。此外，OsECT-g在干旱脅迫的葉片中表達(dá)量顯著下降。推測(cè)這些基因可能參與到在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答過(guò)程。

綜上所述，通過(guò)對(duì)水稻ECT基因家族的鑒定和綜合分析，為后期基因功能研究提供了有價(jià)值的線(xiàn)索。OsECT基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式分析，有助于揭示水稻ECT基因家族的進(jìn)化特征和基因功能。OsECT基因的組織表達(dá)特異性和干旱脅迫響應(yīng)，表明在生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中可能發(fā)揮著重要作用。其研究結(jié)果為挖掘OsECT家族參與m6A甲基化過(guò)程的生物學(xué)功能和應(yīng)用潛力奠定了基礎(chǔ)。