張 靜， 程 敏， 金 倩， 曹鵬博， 周鋼橋,*

(1)河北大學 生命科學學院生物學系，河北， 保定 071002；2)軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室，國家蛋白質(zhì)科學中心(北京)， 北京 100850；3)南京醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院流行病學系， 南京 211166；4)徐州醫(yī)科大學 腫瘤生物治療研究所，江蘇， 徐州 221002)

膽管癌(cholangiocarcinoma, CCA)是一種難治且高危的惡性腫瘤，一般被分為肝內(nèi)膽管癌、肝門區(qū)膽管癌和肝外膽管癌三種類型[1]。在全球范圍內(nèi)，CCA發(fā)病率表現(xiàn)出地理差異，東方地區(qū)的發(fā)病率遠高于西方[2]。這些差異可能反映了地理和遺傳風險因素的重要性[3]。我國是世界上CCA發(fā)病率最高的國家之一[4]。由于目前缺乏很好的早期檢測和診斷方法，大部分CCA患者被發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，手術(shù)切除術(shù)仍是目前CCA唯一有效的治療手段。然而，由于CCA易向膽管壁浸潤，并侵襲周圍血管、神經(jīng)及淋巴組織等，因此手術(shù)切除率很低，患者總體預后較差[5, 6]。即使部分患者能夠?qū)嵤┦中g(shù)切除，術(shù)后復發(fā)的概率仍然很高。因此，研究CCA的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，探尋新的治療靶標和預后指標，對于提高CCA的防診治水平具有重要意義。

多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1(polypyrimidine tract-binding protein 1, PTBP1)是核不均一核糖核蛋白質(zhì)家族(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, HnRNP)中的一員[7]。已有研究表明，PTBP1可以在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，調(diào)控信使RNA(messenger RNA, mRNA)的可變剪接(alternative splicing, AS)、多聚腺苷酸化、亞細胞定位、穩(wěn)定性和翻譯等過程[8, 9]。真核轉(zhuǎn)錄物的可變剪接是一種普遍存在的基因表達調(diào)控機制，是指通過不同的剪接方式對前體mRNA中的外顯子和內(nèi)含子進行組合，產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程[10]。不同的剪接異構(gòu)體之間的差異可能會影響mRNA的亞細胞定位、穩(wěn)定性或翻譯等過程，增加蛋白質(zhì)組的復雜性，從而極大地拓展基因功能的多樣性[11]。作為可變剪接調(diào)控因子，PTBP1蛋白具有4個與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，可直接結(jié)合RNA，調(diào)控mRNA的可變剪接過程，使剪接異構(gòu)體編碼不同功能的蛋白質(zhì)，從而影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[12, 13]。例如，在膀胱癌細胞中，PTBP1通過調(diào)節(jié)MACF1的可變剪接過程，促進膀胱癌細胞的增殖[14]；在晚期肝癌臨床模型中，PTBP1可參與EXOC7的剪接過程，調(diào)控衰老相關(guān)分泌表型，從而促進肝癌的進展[15]。然而，PTBP1通過調(diào)控可變剪接影響膽管癌進展的研究迄今尚未有報道。本研究旨在通過探索PTBP1對膽管癌細胞的生長、遷移和侵襲能力的影響，并檢測其調(diào)控的可變剪接事件，以期初步揭示其在膽管癌進展中的作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和載體

人膽管癌細胞系RBE和HuH28均來自本實驗室細胞庫；用于基因過表達的克隆載體pLVX-Puro購自北京擎科生物科技有限公司；用于敲低PTBP1基因的siRNA片段由金拓思生物科技有限公司合成。

1.2 主要試劑

siRNA轉(zhuǎn)染試劑riboFECTTMCP購自廣州銳博生物公司；CCK-8檢測試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Transwell小室(353097)和Invasion小室(354480)均購自美國BD-Biocoat；SYBR Green 熒光定量試劑盒購自美國Kapa；RIPA(強)細胞/組織蛋白質(zhì)裂解液及RNA提取試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR試劑購自上海TOYOBO生物科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

實驗所用培養(yǎng)基均為含10% FBS和1%青、鏈霉素雙抗的(dulbecco’s modified eagle’s medium, DMEM)，人膽管癌細胞系RBE和HuH28的培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，并保持一定的濕度。

1.4 構(gòu)建穩(wěn)定過表達PTBP1的膽管癌細胞系

分別將慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、pSPAX2與目的質(zhì)粒(pLVX或pLVX-PTBP1)按1∶2∶3的比例共轉(zhuǎn)染于HEK293T細胞系，8 h后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h時收集富含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清液，用0.45 μm濾器過濾以除去細胞碎片。取1 mL含有病毒顆粒的上清液與1 mL 含10% FBS的培養(yǎng)基混勻，并加入5 μg/mL的Polybrene感染RBE和HuH28，48 h時加入終濃度為2 μg/mL嘌呤霉素進行篩選。

1.5 siRNA的轉(zhuǎn)染

設計和合成2條針對PTBP1基因的siRNA片段(分別為：siPTBP1-1，5′-GCACAGTGTTGAAGA TCAT-3′；siPTBP1-2，5′-GCGTGAAGATCCTGTTCAA-3′)，將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑室溫孵育15 min，制成轉(zhuǎn)染復合物，轉(zhuǎn)染至RBE和HuH28細胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.6 Western印跡分析

配制10%濃度的SDS-PAGE膠進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉70 min、4 ℃過夜，孵育一抗、TBST洗膜、室溫孵育二抗90 min、TBST洗膜，最后進行顯影。PTBP1抗體(32-48 000；1∶1 000)購自美國Invitrogen；GAPDH抗體(60004-1-Ig；1∶2 000)購自美國Proteintech；鼠源二抗(CW0102M；1∶1 000)購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照試劑盒說明書進行細胞總RNA的提取。再取500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以2 μL cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)擴增實驗(詳細引物信息見Table 1)。所有樣本均設3個重復，以GAPDH基因為對照，使用△△Ct法對mRNA定量結(jié)果進行歸一化處理。所有PCR實驗均進行熔解曲線分析，以排除非特異性擴增。

1.8 細胞生長能力的檢測

在細胞生長實驗中，取對數(shù)生長期細胞，按2 000個/孔細胞量接種于96孔板中。待細胞貼壁后，吸棄原有的培養(yǎng)基，加入100 μL含10% CCK-8試劑的無雙抗DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育90 min后測定450 nm處的光密度值(A450)。每隔24 h重復檢測1次，連續(xù)觀測5～6 d。在細胞平板克隆實驗中，同樣取用對數(shù)生長期細胞，按700個/孔細胞量接種于6孔板中。培養(yǎng)10～15 d，期間每隔3 d換液1次，敲低組每隔3 d瞬轉(zhuǎn)1次siRNA，以維持細胞中PTBP1的低表達狀態(tài)。待出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色15 min。最后，洗凈并晾干平板，對克隆進行拍照、計數(shù)和統(tǒng)計分析。

1.9 細胞遷移和侵襲能力的檢測

采用Transwell實驗檢測細胞的遷移能力。取對數(shù)生長期細胞，無血清DMEM饑餓處理12 h。饑餓完畢后，用無血清DMEM重懸細胞，稀釋成3 × 105個/mL。在Transwell小室內(nèi)加入200 μL上述細胞懸液，在小室外加入800 μL含20% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～40 h，4%多聚甲醛固定小室30 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min。最后，洗凈并晾干小室，在顯微鏡下隨機選取3個不同的視野，對穿過小室的細胞進行拍照、計數(shù)和統(tǒng)計分析。采用Invasion實驗檢測細胞的侵襲能力?；静襟E同上述的Transwell法，不同之處在于所鋪細胞量為Transwell實驗的2倍，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～48 h后，取出小室固定、染色、清洗、拍照和計數(shù)統(tǒng)計。

1.10 轉(zhuǎn)錄物組測序及基因表達定量分析

提取敲低PTBP1及對照組的膽管癌細胞RBE中的RNA，由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司在Illumina HiSeq X Ten平臺上采用150堿基對(base pair, bp)的雙端配對策略進行轉(zhuǎn)錄物組測序(RNA-seq)。隨后，采用FastQC軟件對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評價，并利用trim-galore去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)和接頭序列[16]。以Genome Reference Consortium Human Build 38(GRCh38/hg38)基因組序列為參考，采用salmon對通過質(zhì)量評估的測序數(shù)據(jù)進行序列比對和定量[17]。并利用DESeq[18]軟件進行基因差異表達分析，采用Benjamin-Hochberg(BH)方法對其進行多重檢驗校正，將敲低PTBP1前后log2[fold change] > 0.3及P< 0.05的基因定義為顯著差異表達基因。最后，使用Metascape[19]網(wǎng)站對顯著差異表達基因進行功能富集分析，以鑒定PTBP1在膽管癌中影響的生物學過程和/或信號通路。

1.11 轉(zhuǎn)錄物組的可變剪接分析

基于前述轉(zhuǎn)錄物組測序數(shù)據(jù)，采用SUPPA2[20]鑒定PTBP1可能參與調(diào)控的可變剪接事件。首先，本文使用Wilcoxon符號秩檢驗比較了對照組和敲低組剪接事件的剪入百分比(percent spliced in, PSI)差異。再采用BH方法進行多重檢驗校正。本文將剪接事件平均∣ΔPSI∣ > 0.1且P< 0.05的剪接事件定義為顯著差異的可變剪接事件。

1.12 半定量PCR法檢測基因的剪接亞型

提取各組細胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應獲得cDNA，對cDNA進行半定量PCR實驗。利用Primer3[21]網(wǎng)站，將基因上游引物設計在被剪接的外顯子之前，將下游引物設計在被剪接的外顯子之后，詳細引物信息見Table 1。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min后開始如下循環(huán)：94 ℃變性反應30 s，62 ℃退火反應30 s，72 ℃延伸反應30 s，經(jīng)過30個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸5 min，最后將反應產(chǎn)物置于4 ℃短暫保存。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在220 V電壓和120 mA電流下電泳約25 min。最后，使用Tanon Gel Image System儀器對凝膠電泳條帶進行觀察并拍照，并采用Tannon Image(版本1.1)軟件對剪接亞型進行定量分析。

Table 1 The sequences of primers for PCR assays

1.13 轉(zhuǎn)錄物在膽管癌和癌旁組織中的表達差異分析

首先，從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載獲得膽管癌患者(包括 36 例膽管癌組織和9例鄰近非腫瘤組織)的 RNA轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。再使用Wilcox.test分別比較了TGIF1-L、TGIF1-S、GNAS-L及GNAS-S轉(zhuǎn)錄物在膽管癌和癌旁組織中的表達差異。

1.14 統(tǒng)計學分析

癌和癌旁組織間PTBP1的差異表達分析采用雙側(cè)t檢驗。所有實驗均重復至少3次。在所有統(tǒng)計學檢驗中，P< 0.05視為具有顯著性意義。所有統(tǒng)計學檢驗采用SPSS(版本16.0)統(tǒng)計軟件完成，數(shù)據(jù)的可視化采用GraphPad(版本8.0.2)完成。

2 結(jié)果

2.1 多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1在膽管癌組織中顯著上調(diào)表達

本研究采用基因表達譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.)平臺[22]，在TCGA的31種癌組織及其相應癌旁組織中分析了PTBP1 mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，約1/3癌癥類型的癌組織中PTBP1的表達均顯著高于對應的癌旁非腫瘤組織(Fig.1A)。其中，PTBP1在膽管癌組織中的mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P< 0.05; Fig.1B)。因此，本文推測，PTBP1可能在膽管癌中發(fā)揮癌基因的功能。

Fig.1 Expression of PTBP1 mRNA in cancer tissues and the matched non-tumor tissues (A) The mRNA expression levels of PTBP1 in 31 types of tumor tissues and adjacent non-tumor tissues from TCGA. (B) GEPIA database was used to obtain the PTBP1 expression levels in cholangiocarcinoma tissues (n = 36) and the matched normal tissues (n=9). ACC, adrenocortical carcinoma; BLCA, bladder urothelial carcinoma; BRCA, breast invasive carcinoma; CESC, cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma; CHOL, cholangiocarcinoma; COAD, colon adenocarcinoma; DLBC, diffuse large B-cell lymphoma; ESCA, esophageal carcinoma; GBM, glioblastoma multiforme; HNSC, head and neck squamous cell carcinoma; KICH, kidney chromophobe; KIRC, kidney renal clear cell carcinoma; KIRP, kidney renal papillary cell carcinoma; LAML, acute myeloid leukemia; LGG, brain lower grade glioma; LIHC, liver hepatocellular carcinoma; LUSC, lung squamous cell carcinoma; OV, ovarian serous cystadenocarcinoma; PAAD, pancreatic adenocarcinoma; PCPG, pheochromocytoma and paraganglioma; PRAD, prostate adenocarcinoma; READ, rectum adenocarcinoma; SARC, sarcoma; SKCM, skin cutaneous melanoma; STAD, stomach adenocarcinoma; TGCT, testicular germ cell tumors; THCA, thyroid carcinoma; THYM, thymoma; UCEC, uterine corpus endometrial carcinoma; UCS, uterine carcinosarcoma. *P < 0.05

2.2 多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1促進膽管癌細胞的生長能力

為了進一步研究PTBP1在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學功能，本文通過慢病毒包裝的方法構(gòu)建了穩(wěn)定過表達PTBP1的膽管癌細胞株，通過轉(zhuǎn)染特異性靶向PTBP1的siRNA，構(gòu)建了瞬時敲低PTBP1的膽管癌細胞株。本文采用qRT-PCR及Western印跡檢測以驗證PTBP1的過表達和敲低效果。結(jié)果顯示，在RBE和HuH28細胞中，與對照組(pLVX)相比，過表達(pLVX- PTBP1)組中PTBP1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達均顯著增加，證明成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達PTBP1的細胞株(Fig.2A)；與對照組(siCtrl)相比，敲低(siPTBP1-1和siPTBP1-2)組中PTBP1 在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達均顯著降低，證明成功抑制了內(nèi)源性PTBP1的表達(Fig.2B)。進一步采用CCK-8實驗評價PTBP1對膽管癌細胞生長能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達PTBP1可顯著促進RBE和HuH28細胞的生長能力(P< 0.01; Fig.2C)，而敲低PTBP1則顯著抑制RBE和HuH28細胞的生長能力(P< 0.001; Fig.2D)。此外，本文還通過細胞平板克隆實驗，以檢測PTBP1對膽管癌細胞克隆生長能力的影響。結(jié)果顯示，過表達PTBP1可顯著促進RBE和HuH28細胞的克隆生長能力(P< 0.001; Fig.2E)，而敲低PTBP1則顯著抑制RBE和HuH28細胞的克隆生長能力(P< 0.001; Fig.2F)。這些結(jié)果表明，PTBP1促進膽管癌細胞的生長能力。

Fig.2 PTBP1 promotes the growth ability of CCA cells in vitro (A, B) Left: Relative expression levels of PTBP1 in RBE and HuH28 cells expressing pLVX, pLVX-PTBP1, siCtrl or siPTBP1, detected by qRT-PCR assays. Right: The protein levels of PTBP1 in RBE and HuH28 cells expressing pLVX, pLVX-PTBP1, siCtrl or siPTBP1, detected by Western blot assays. (C, D) The CCK-8 assays were used to evaluate the growth abilities of RBE and HuH28 cells upon PTBP1 overexpression (C) or knockdown (D). (E, F) The cell growth capacity was assessed by colony formation assays in RBE and HuH28 cells upon PTBP1 overexpression (E) or knockdown (F). The cells were seeded in 6-well plates for 15 days followed by staining and quantification. Data are shown as mean ± SEM (standard error of mean) of three independent experiments, two-tailed Student t test. **P < 0.01, ***P < 0.001

2.3 多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1促進膽管癌細胞的遷移和侵襲能力

為評價PTBP1是否影響膽管癌細胞系的遷移及侵襲能力，本文在膽管癌細胞RBE和HuH28中穩(wěn)定過表達和瞬時敲低PTBP1，進行Transwell遷移(Fig.3A, B)和Invasion侵襲(Fig.3C, D)實驗。結(jié)果顯示，PTBP1過表達可顯著促進膽管癌細胞的遷移和侵襲能力(P< 0.001)，而敲低PTBP1則顯著抑制膽管癌細胞的遷移和侵襲能力(P< 0.001)。上述結(jié)果表明，PTBP1促進膽管癌細胞的生長、遷移及侵襲能力，在膽管癌進展中可能發(fā)揮癌基因的功能。

Fig.3 PTBP1 promotes the migration and invasion abilities of CCA cells in vitro (A, B) Transwell assays were applied to detect the migration ability of CCA cells with overexpression or knockdown of PTBP1. (C, D) Invasion assays showed the effect of PTBP1 on the invasion ability in RBE and HuH28 cells. Representative images of migratory or invasive cells on the membrane were presented in the left panel. Scale bar, 100 μm. Data are shown as mean ± SEM (standard error of mean) of three independent experiments, two-tailed Student t test. ***P < 0.001

2.4 多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1參與調(diào)控多條腫瘤相關(guān)信號通路

為探索PTBP1促進膽管癌進展的作用機制，本文在RBE細胞中特異性地敲低PTBP1并進行RNA-seq實驗。主成分分析(principal component analysis, PCA)結(jié)果顯示，對照組細胞的轉(zhuǎn)錄物組與敲低PTBP1組細胞的轉(zhuǎn)錄物組顯著分散并各自成群(Fig.4A)。差異表達基因分析顯示，敲低PTBP1顯著上調(diào)87個基因的表達，下調(diào)120個基因的表達(Fig.4B, C; Supplementary Table 1)。隨后，本文分別對上調(diào)表達基因和下調(diào)表達基因進行功能富集分析。結(jié)果顯示，PTBP1負調(diào)控的基因顯著富集于p53信號通路、鐵死亡及DNA損傷誘導的細胞衰老過程等抑癌信號通路(Fig.4D)，提示PTBP1可能通過抑制p53等抑癌信號通路來發(fā)揮促癌功能。此外，本文發(fā)現(xiàn)PTBP1正調(diào)控的基因顯著富集于膽固醇代謝、細胞周期、Rho GTP酶、TGF-β及Hippo等促癌信號通路(Fig.4E)，提示在膽管癌惡化過程中，PTBP1可能通過激活多條促癌信號通路，從而促進膽管癌的進展。

Fig.4 PTBP1 regulates multiple cancer-associated signaling pathways (A) The principal component analysis (PCA) plot showed that the control and PTBP1-depleted RBE cells were clearly separated. PC, principal component. (B) The volcano plot showed the differentially expressed genes (log2[fold-change] > 0.3, P < 0.05) in PTBP1-depleted RBE cells compared to control cells. (C) The heatmap of the 207 differently expressed genes. (D, E) Functional enrichment analyses of up-regulated genes (D) and down-regulated genes (E) in PTBP1-depleted RBE cells

2.5 多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1調(diào)控基因的可變剪接過程

已有研究表明，PTBP1可作為剪接因子發(fā)揮重要的生物學功能[9]。為進一步深入研究PTBP1促進膽管癌細胞惡性進展的作用機制，本文基于上述RNA-seq數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了敲低PTBP1所誘導的差異可變剪接事件?？勺兗艚邮录饕譃?種基本類型：外顯子跳躍(skipped exon, SE)、可變5′剪接位點(alternative 5′ splicing site , A5)、可變3′剪接位點(alternative 3′ splicing site , A3)、互斥可變外顯子(mutually exclusive exons, MX)、內(nèi)含子保留(retained intron, RI)、可變初始外顯子(alternative first exon, AF)和可變終末外顯子(alternative last exon, AL)剪接事件(Fig.5A)[11]。本文的分析結(jié)果顯示，敲低PTBP1導致159個可變剪接事件發(fā)生顯著變化(P< 0.005, ∣ΔPSI∣ > 0.1; Fig.5B-D; Supplementary Table 2)。

Fig.5 PTBP1 promotes oncogenic splicing of TGIF1 and GNAS (A) Schematic diagrams of the main types of alternative splicing events. Exons are represented by boxes, and diagonal lines indicate alternative splicing (AS) events. (B) The volcano plot shows significantly aberrant AS events (∣ΔPSI∣ > 0.1, P < 0.05) in PTBP1-depleted RBE cells compared to control cells. (C) Number of splicing events detected for 7 kinds of AS events regulated by PTBP1. (D) The heatmap of significantly aberrant AS events regulated by PTBP1. (E) Knockdown of PTBP1 promotes the skipping of TGIF1 exon 5 and GNAS exon 2 retention determined by RNA-seq analyses in RBE cells. The PSI values are indicated for each sample. (F) Schematic diagrams of alternative splicing events within TGIF1 and GNAS. Exons (boxes) and introns (lines) are indicated. (G) Semi-quantitative PCR assays of in vitro splicing shows regulatory effects of PTBP1 on the exon 5 skipping of TGIF1 and the exon 2 retention of GNAS in RBE and HuH28 cells. (H) Densitometric analyses of the splicing assays shown in (E). (I) Expression of TGIF1-L, TGIF1-S, GNAS-L and GNAS-S transcripts in cholangiocarcinoma tissues (n=36) and the matched non-tumor tissues (n=9). PSI, percent spliced in; E, exon; Fw, forward; Rv, reverse. RSEM, RNA-seq by expectation-maximization. *P < 0.05, **P < 0.01

事實上，已有研究證實，剪接因子可通過調(diào)控可變剪接事件變化來影響p53[23]、鐵死亡[24]、膽固醇代謝[25]、細胞周期[26]、Rho GTPase[27]、TGF-β[28]及Hippo[29]等多種信號通路，從而促進腫瘤的進展。在PTBP1調(diào)控的159個可變剪接事件中，本文首先關(guān)注了SE剪接事件中綜合排名前10位的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中包含了TGF-β信號通路活性抑制基因TGIF1(Fig.5E, F)[30]。已有研究表明，TGIF1基因經(jīng)過可變剪接過程可產(chǎn)生12種剪接異構(gòu)體[31]。本文發(fā)現(xiàn)，在RBE細胞中敲低PTBP1，TGIF1的5號外顯子發(fā)生跳躍，導致TGIF1-L亞型向TGIF1-S亞型轉(zhuǎn)換。隨后，采用半定量PCR實驗證實，PTBP1在膽管癌細胞RBE和HuH28中可抑制TGIF1的 5號外顯子的SE事件，從而誘導TGIF1-S亞型向TGIF1-L亞型的轉(zhuǎn)換(Fig.5G, H)。TGIF1-S已被報道在口腔鱗癌細胞中低表達，可能發(fā)揮抑癌功能[32]。

本文重點關(guān)注了分布最為廣泛的AF剪接事件。在綜合排名前10位的基因中，發(fā)現(xiàn)了與p53通路相關(guān)的基因GNAS(Fig.5E, F)[33]。GNAS被證實存在多個轉(zhuǎn)錄物，而這些轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生大多數(shù)是由于外顯子1和外顯子2的剪接所引起[34]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RBE細胞中敲低PTBP1，GNAS的2號外顯子剪接異構(gòu)體(GNAS-L)向1號外顯子剪接異構(gòu)體(GNAS-S)轉(zhuǎn)換。進一步采用半定量PCR方法證實，在膽管癌細胞中，PTBP1參與調(diào)控GNAS的2號外顯子的AF事件，誘導GNAS-L亞型的表達(Fig.5 G, H)。已有研究表明，GNAS-L包含RAS同源結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控G蛋白質(zhì)激活及GTP酶活性，是腫瘤潛在的治療靶點[35]。與此一致的是，通過分析TCGA膽管癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，TGIF1-L和GNAS-L亞型均在膽管癌組織中上調(diào)表達，而TGIF1-S和GNAS-S亞型均在膽管癌組織下調(diào)表達(Fig.5I)。由于樣本量較小，個別組間差異顯著性處于閾值臨界。隨著樣本量的增加，此差異可能趨于顯著。綜上所述，PTBP1作為剪接因子參與調(diào)控了多個促癌可變剪接事件，引起多條腫瘤相關(guān)信號通路的紊亂，從而促進膽管癌的惡性進展。

3 討論

膽管癌是一種致死率極高的癌種，治療方案非常有限，以手術(shù)治療為主，但復發(fā)風險極高[36]。目前，膽管癌的確切病因尚不明確，可能與膽道結(jié)石、酒精性肝病、非特異性肝硬化、遺傳因素及慢性膽管炎等相關(guān)[37]。近年來，膽管癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，通?；颊咴诓〕掏砥跁r才被確診，導致患者較低的治愈率[38]。因此，鑒定膽管癌相關(guān)基因并探索其致病機制，對膽管癌的防診治具有重大意義。

HnRNP蛋白質(zhì)家族是廣泛表達的一類RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，參與mRNA的轉(zhuǎn)運、代謝、剪切及表達等過程的調(diào)控，進而影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[39, 40]。作為hnRNP蛋白質(zhì)家族中的一員，PTBP1已被證明在多種腫瘤組織中上調(diào)表達，且其高表達與患者的不良預后顯著相關(guān)[41]。但其在膽管癌中的生物學功能一直未見報道。本研究中發(fā)現(xiàn)，PTBP1在膽管癌組織中上調(diào)表達，細胞學水平的功能研究證實，PTBP1可以促進膽管癌細胞的生長、遷移及侵襲，提示PTBP1在膽管癌的發(fā)展中可能作為癌基因而發(fā)揮功能。

已有多項研究顯示，PTBP1可調(diào)控多個腫瘤相關(guān)基因的可變剪接過程，進而影響腫瘤細胞的生物學行為[9]。例如，PTBP1可通過調(diào)控PKM2的可變剪接而影響Warburg效應[42]。Warburg效應是癌細胞特異性的能量代謝過程，已被公認是癌癥的一個關(guān)鍵特征[43]。事實上，許多基因?qū)δ[瘤的影響之所以不能簡單用“致癌”或“抑癌”來定義，正是因為這些基因可通過可變剪接過程，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特性和生物學功能不同、甚至相反的剪接異構(gòu)體[44, 45]。探索腫瘤中的可變剪接事件可為腫瘤的防治，以及藥物的研發(fā)提供新的線索。

為揭示PTBP1在膽管癌中發(fā)揮促癌功能的機制，本文利用轉(zhuǎn)錄物組測序發(fā)現(xiàn)，PTBP1可廣泛地參與轉(zhuǎn)錄物組的可變剪接調(diào)控，最終干擾p53、鐵死亡、DNA損傷誘導的細胞衰老、膽固醇代謝、細胞周期、Rho GTP酶、TGF-β及Hippo等多條腫瘤相關(guān)信號通路。其中，p53是著名的抑癌基因，參與調(diào)控周期阻滯、凋亡和代謝等生物學過程[46]。在絕大多數(shù)腫瘤細胞中p53會發(fā)生突變，引起基因組不穩(wěn)定性，從而增強癌細胞的增殖能力及耐藥性[47]。已有報道發(fā)現(xiàn)，PTBP1可通過介導EXOC7等基因的可變剪接來調(diào)控腫瘤細胞衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)[15]。此外，有研究報道，在肝細胞癌中，高表達的長非編碼RNA MEG3可結(jié)合PTBP1，誘導并促進SHPmRNA的降解，從而破壞膽固醇穩(wěn)態(tài)并誘導肝硬化[48]。TGF-β信號通路在癌癥進展中具有關(guān)鍵作用，由配體、受體、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子SMAD蛋白質(zhì)等組成[49]。當通路中任一元件發(fā)生異常時，均可引起信號轉(zhuǎn)導過程紊亂，從而導致腫瘤的惡性進展[50]。

本文通過實驗證實了PTBP1可調(diào)控TGF-β信號通路相關(guān)基因TGIF1及p53信號通路相關(guān)基因GNAS的可變剪接事件。已有研究表明，在肝癌細胞中TGIF1的表達異?？烧T導膽固醇代謝過程發(fā)生紊亂，從而促進腫瘤的進展[51]。在結(jié)直腸癌細胞中，TGIF1表達上調(diào)并促進TGF-β信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)的表達，從而促進腫瘤的惡性進展[52]。在胰腺導管腺癌中，p53基因的缺失可誘導GNAS發(fā)生突變，從而促進腫瘤的惡性進展[33]。GNAS是迄今為止多數(shù)垂體腺瘤的唯一分子標記物，經(jīng)過可變剪接過程產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄物；而不同轉(zhuǎn)錄物之間的轉(zhuǎn)換可引起cAMP通路失調(diào)，從而促進垂體腺瘤的進展[34]。然而，TGIF1與GNAS基因可變剪接體之間的轉(zhuǎn)換在腫瘤進展中的詳細功能至今未被揭示。也未有研究報道，PTBP1調(diào)控TGIF1與GNAS可變剪接事件的潛在腫瘤生物學功能。這提示，PTBP1促進膽管癌具體的作用機制、其參與調(diào)控的可變剪接事件、誘導TGF-β及p53等信號通路紊亂的機制仍有待進一步地深入研究。

總之，本文新發(fā)現(xiàn)了PTBP1在膽管癌中可能發(fā)揮癌基因的功能，并初步探索了其在膽管癌進展中的機制線索。未來我們將進一步探索PTBP1在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的腫瘤生物學功能和其分子機制。