王春曉，郝李振，李旦旦，肖靜

水解蛋白酶ZL-1在飼料魚(yú)溶漿中的酶解應(yīng)用

王春曉1，郝李振1，李旦旦1，肖靜2

（1. 濟(jì)南正隆生物科技有限公司，山東 濟(jì)南 250109；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院） 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

魚(yú)溶漿是魚(yú)粉加工副產(chǎn)物，富含蛋白，漿液粘度大．酶解加工魚(yú)溶漿有利于將大分子蛋白質(zhì)水解成肽和氨基酸等，降低漿液粘度，從而提高魚(yú)溶漿的營(yíng)養(yǎng)性及加工運(yùn)輸性．采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)分析法系統(tǒng)研究并優(yōu)化了利用ZL-1酶解魚(yú)溶漿的工藝條件．得到的最佳酶解條件為：漿料濃度為10%，溫度為55 ℃，不調(diào)節(jié)pH，ZL-1的加酶量為0.75%干物質(zhì)濃度，酶解時(shí)間為2 h．最佳的工藝實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證結(jié)果表明，水解液中的氨基氮含量比優(yōu)化前提升了129.47%，粘度降低了84.83%，用酶處理魚(yú)溶漿顯著增加了其流動(dòng)性．

魚(yú)溶漿；酶解；氨基氮

魚(yú)粉是目前水產(chǎn)飼料不可或缺的重要原材料之一，是水產(chǎn)動(dòng)物重要的蛋白來(lái)源[1-2]．由于鮮魚(yú)的含水量約占75%[3]，在魚(yú)粉的制作過(guò)程中，大量的水溶性物質(zhì)在蒸煮、壓榨后分體形成液體，這些液體即為魚(yú)溶漿[4-5]．

Ahmad[6]等研究了魚(yú)溶漿對(duì)大豆?jié)饪s蛋白的增塑和結(jié)合作用，證實(shí)了魚(yú)溶漿在魚(yú)飼料擠出過(guò)程中用作增塑劑和粘合劑的潛力．Espe[7]等發(fā)現(xiàn)向大西洋鮭（）基于植物蛋白的日糧中添加魚(yú)溶漿，并不會(huì)影響其自愿采食量和改善其生長(zhǎng)．我國(guó)魚(yú)粉年產(chǎn)量30多萬(wàn)t，每生產(chǎn)1 t魚(yú)粉，大約產(chǎn)生2～3 t榨汁[8]，早期魚(yú)粉生產(chǎn)工藝過(guò)程中，這些榨汁通常不經(jīng)過(guò)回收直接向環(huán)境中排放，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[9-10]．在魚(yú)飼料中添加魚(yú)溶漿代替魚(yú)粉，可有效節(jié)約魚(yú)粉，緩解魚(yú)粉生產(chǎn)過(guò)程中的環(huán)境污染問(wèn)題，并有促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)的作用．周露陽(yáng)[11]等的研究報(bào)道，在黃顙魚(yú)（）日糧中添加8.5%的酶解魚(yú)溶漿可完全替代28%的魚(yú)粉，且酶解魚(yú)溶漿促生長(zhǎng)效果優(yōu)于魚(yú)溶漿．經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)溶漿含有大量的小分子多肽、氨基酸、?；撬嵋约暗V物質(zhì)等有益成分，保留了魚(yú)粉特有的未知生長(zhǎng)因子[12]，對(duì)水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖動(dòng)物具有很好的誘食和促生長(zhǎng)作用，是很好的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白源、誘食劑和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[13-14]．傳統(tǒng)的魚(yú)溶漿要經(jīng)過(guò)加工濃縮后進(jìn)行售賣，但這些魚(yú)溶漿還含有較多的大分子蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、蛋白胨等[15]，導(dǎo)致物料粘稠，降低了養(yǎng)殖動(dòng)物的消化利用率．通過(guò)加工和酶解處理可以將魚(yú)溶漿中的大分子蛋白質(zhì)水解成小分子多肽和游離氨基酸，這樣不僅可以提高其流動(dòng)性，還能增加吸收利用率[16-18]．因此，將魚(yú)溶漿經(jīng)過(guò)酶解處理可以進(jìn)一步地拓展魚(yú)溶漿的應(yīng)用范圍．

近年來(lái)，越來(lái)越多的生產(chǎn)企業(yè)嘗試通過(guò)酶處理魚(yú)溶漿，提高其利用效率，將其作為替代魚(yú)粉，用作飼料添加劑的最優(yōu)原料選擇[19-20]．為了更好地適應(yīng)行業(yè)需求，結(jié)合實(shí)際工藝，將酶解魚(yú)溶漿的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化處理，以酶解液黏度和氨基氮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，為優(yōu)質(zhì)低廉魚(yú)溶漿的開(kāi)發(fā)利用提供較好的途徑和方法．

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

HT1150ATC型折光儀（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；5810R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；UV-6100型熒光分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；NDJ-5S型數(shù)字式黏度計(jì)（上海衡平儀器儀表廠）；YP6102型電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；HH-4型恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）．

魚(yú)溶漿（煙臺(tái)某水產(chǎn)公司）；堿性蛋白酶，中性蛋白酶，菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶（山東隆科特酶制劑有限公司）；魚(yú)溶漿水解蛋白酶ZL-1，ZL-2（實(shí)驗(yàn)室研發(fā)自配）；甘氨酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，水合茚三酮，果糖，碘酸鉀，無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）．

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取相同量的魚(yú)溶漿（干物質(zhì)濃度為20%），分別加入相應(yīng)酶活力的ZL-1、ZL-2、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，于55 ℃恒溫水浴中分別酶解2 h．酶解結(jié)束后，將樣品放置90℃水浴中10 min，使酶失活，通過(guò)茚三酮比色素法分別檢測(cè)酶解后溶解中的氨基氮含量．在多種蛋白酶理論最適條件下進(jìn)行酶解，確定酶解時(shí)間，根據(jù)測(cè)定酶解液的游離氨基氮含量變化為指標(biāo)確定各蛋白酶的酶解效果．一般以酶解液黏度為檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)行單因素酶解預(yù)實(shí)驗(yàn)，選定蛋白酶的正交實(shí)驗(yàn)因素水平[21]，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解液的粘度為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素選擇溫度、漿料濃度和加酶量等3個(gè)因素，并設(shè)置3個(gè)水平，進(jìn)行L9（33）正交實(shí)驗(yàn)[22]．對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差和回歸分析，從而得出最優(yōu)的酶解條件組合，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證．實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為測(cè)定結(jié)果的平均值．

1.2.2原料處理將原魚(yú)溶漿（干物質(zhì)濃度55%左右）按照各實(shí)驗(yàn)需求稀釋至相應(yīng)的漿料濃度，分裝，并按實(shí)驗(yàn)方案添加相應(yīng)的酶．水浴溫度和時(shí)間按相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案安排．酶解完成后取酶解后1/2的魚(yú)溶漿加熱蒸煮酶解液進(jìn)行濃縮，使用折光儀檢測(cè)濃縮后漿料干物質(zhì)濃度至50%[23]，室溫靜置過(guò)夜后檢測(cè)濃縮后漿料的粘性；取另1/2酶解后的魚(yú)溶漿通過(guò)6 000 r/min離心3 min，收集上清液，檢測(cè)游離氨基氮含量．

1.2.3黏性檢測(cè)使用數(shù)字式粘度計(jì)檢測(cè)濃縮酶解液粘度，設(shè)置檢測(cè)參數(shù)為：轉(zhuǎn)子3，測(cè)速60 r/min，溫度為22℃．

1.2.4氨基氮測(cè)定方法氨基氮含量的測(cè)定采用茚三酮比色法[24]．魚(yú)溶漿蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布及占比、酸溶蛋白氮含量參考國(guó)標(biāo)《GB/T 22729—2008海洋魚(yú)低聚肽粉》中的方法．

1.3　數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro8.5，SPASS8.1，DPS1.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及圖表制作，方差分析的顯著性水平為<0.05．

2　結(jié)果分析與討論

2.1　蛋白酶的選擇

不同酶對(duì)魚(yú)溶漿中氨基氮含量變化的影響見(jiàn)圖1．由圖1可見(jiàn)，在其它酶解條件相同的情況下，在魚(yú)溶漿中加入等量的不同種類的蛋白酶，酶解2 h后，不同蛋白酶對(duì)魚(yú)溶漿酶解后產(chǎn)生的氨基氮含量不同．與空白對(duì)照相比，酶解液中氨基氮含量最高的是ZL-1，為6 259.0 mg/L，其次是堿性蛋白酶、胰蛋白酶和ZL-2，分別為5 333.2，4 971.0，4 841 mg/L．而菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶對(duì)魚(yú)溶漿具有一定的酶解作用，但酶解效果相對(duì)較差．綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇氨基氮含量最高的ZL-1進(jìn)行魚(yú)溶漿酶解條件優(yōu)化．

2.2　酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1溫度的影響漿料濃度設(shè)置為20%，將漿料添加0.5%的ZL-1，分別于40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃的恒溫水浴中酶解2 h，將酶解液加熱濃縮至干物質(zhì)濃度為50%，檢測(cè)酶解液粘性．酶解魚(yú)溶漿的粘性隨酶解溫度的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2．

圖1　不同酶對(duì)魚(yú)溶漿中氨基氮含量變化的影響

圖2　溫度對(duì)魚(yú)溶漿粘度的影響

注；不同字母表示組間差異顯著（＜0.05），下同．

由圖2可見(jiàn)，在其它酶解條件相同的情況下，改變酶解的溫度對(duì)魚(yú)溶漿的粘度有顯著影響，隨著恒溫溫度的不斷增加，酶解后的魚(yú)溶漿粘度呈先降低后升高的變化趨勢(shì)．當(dāng)溫度在55～65 ℃時(shí)，粘度趨于平緩，并在55 ℃時(shí)達(dá)到最低，為162.1 mPa·s，但溫度高于65 ℃時(shí)，酶的活性受到溫度的影響較大，對(duì)魚(yú)溶漿的酶解受到影響，因此酶解的魚(yú)溶漿粘度升高．最終確定酶解的最佳溫度為55～65 ℃．

2.2.2加酶量的影響漿料濃度設(shè)置為20%，在漿料中分別添加0.25%，0.5%，0.75%，1%，1.25%的ZL-1，于55℃恒溫水浴中酶解2 h，將酶解液加熱濃縮至干物質(zhì)濃度為50%，檢測(cè)酶解液粘性．酶解魚(yú)溶漿的粘性隨ZL-1用量增加的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3．

由圖3可見(jiàn)，ZL-1的用量對(duì)魚(yú)溶漿的粘度具有顯著影響，隨著加酶量的增加，其粘度逐漸降低．當(dāng)加酶量為0.2%時(shí)，漿料的粘度最大，為375.5 mPa·s，繼續(xù)增加用酶量，粘度快速降低，酶解液的粘度隨加酶量增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)；當(dāng)用酶量為1.25%時(shí)，魚(yú)溶漿的粘度最低，為152.0 mPa·s．當(dāng)魚(yú)溶漿的底物充足時(shí)，增加用酶量可以促進(jìn)魚(yú)溶漿的酶解，增加魚(yú)溶漿的流動(dòng)性．但是酶解底物的質(zhì)量是有限的，過(guò)量添加的ZL-1無(wú)法繼續(xù)再將魚(yú)溶漿酶解，當(dāng)加酶量從0.5%逐漸增加到1.25%時(shí)，粘度趨于平緩，因此確定魚(yú)溶漿酶解的適宜用酶量為0.5%～0.75%．

2.2.3漿料濃度的影響將干物質(zhì)濃度為55%的原漿料稀釋為10%，15%，20%，25%，30%，分別在其中加入0.5%的ZL-1，55℃恒溫水浴中酶解2 h，將酶解魚(yú)溶漿經(jīng)過(guò)加熱濃縮到干物質(zhì)為50%后，檢測(cè)其粘性．酶解液的粘性隨漿料濃度增加的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4．

由圖4可見(jiàn)，同樣的酶解條件下，初始酶解漿料濃度對(duì)酶解后的魚(yú)溶漿粘度具有顯著影響，隨著漿料濃度的增加，酶解后的魚(yú)溶漿粘度逐漸升高．當(dāng)漿料濃度為10%時(shí)，酶解魚(yú)溶漿的粘度最低，為160.3 mPa·s，隨著漿料濃度的增加，酶解后的魚(yú)溶漿粘度逐漸增加．結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需求，最佳的酶解漿料濃度可為10%～30%．

圖3　加酶量對(duì)魚(yú)溶漿粘度的影響

圖4　漿料濃度對(duì)粘度的影響

2.3　酶解工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

酶解工藝參數(shù)優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1．由方差分析可知，酶解溫度、漿料濃度、加酶量對(duì)粘度均具有顯著的影響（<0.05）．對(duì)水解度的影響為：漿料濃度>酶解溫度>加酶量．經(jīng)過(guò)極差分析可知，經(jīng)過(guò)L9（33）正交實(shí)驗(yàn)后，得到ZL-1的酶解最優(yōu)組合條件為：A1B1C3，即酶解漿料濃度為10%，加酶量為0.75%，酶解溫度55℃．

表1　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4　最優(yōu)組合條件驗(yàn)證

選取干物質(zhì)含量為55%的原魚(yú)溶漿稀釋至濃度為10%，加入0.75%的ZL-1，于55℃恒溫水浴中水解2 h，然后滅酶處理檢測(cè)的氨基氮含量，濃縮后測(cè)得酶解液的粘度與未做酶處理的魚(yú)溶漿的對(duì)比（見(jiàn)表2）．

表2　酶解后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的變化

由表2可見(jiàn)，使用理論最優(yōu)條件組合進(jìn)行魚(yú)溶漿的酶解，其粘度低于正交實(shí)驗(yàn)中所有的粘度值，相較未酶解處理的魚(yú)溶漿粘度降低了84.83%，顯著增加了魚(yú)溶漿的流動(dòng)性．酶解后的魚(yú)溶漿氨基氮含量升高了129.47%，表明ZL-1可以有效將魚(yú)溶漿中的大分子蛋白酶酶解成游離的氨基酸、多肽等物質(zhì)．

2.5　酶解工藝在其它物理量上應(yīng)用

將ZL-1的最佳酶解工藝用于蛋白酶酶解效果較好的堿性蛋白酶、胰蛋白酶、ZL-2上，分別檢驗(yàn)酸溶蛋白氮含量、分子量占比及口感，結(jié)果見(jiàn)表3．

表3　其它物理量的對(duì)比應(yīng)用結(jié)果

由表3可見(jiàn)，胰蛋白酶的酸溶蛋白氮含量最高，ZL-1次之，與胰蛋白酶相差不大；在＜500 Da的分子量占比中，ZL-1酶解后的魚(yú)溶漿占100%，平均分子量192.56 Da；在口感上ZL-1、ZL-2的口感較為突出．經(jīng)過(guò)綜合比較發(fā)現(xiàn)，ZL-1在綜合考量下，酶解魚(yú)溶漿的效果最好．

3　結(jié)論

（1）以游離氨基氮的含量為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)多種蛋白酶魚(yú)溶漿進(jìn)行酶解，ZL-1酶解后的氨基氮含量最高，為最佳用酶選擇．

（2）通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法優(yōu)化得到ZL-1酶解魚(yú)溶漿的酶解工藝參數(shù)．ZL-1最佳酶解條件為：酶解漿料濃度為10%，酶解溫度為55℃，加酶量為0.75%，酶解時(shí)間為2 h．在此條件下進(jìn)行魚(yú)溶漿的酶解，可得到濃縮后酶解液的粘度為152.3 m Pa·s，相較于未酶解處理的魚(yú)溶漿粘度降低了84.83%，很大程度上增加了魚(yú)溶漿的流動(dòng)性，酶解后魚(yú)溶漿中游離氨基氮含量也增加了129.47%．

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The enzymatic application of hydrolytic protease ZL-1 in feed fish slurry

WANG Chunxiao1，HAO Lizhen1，LI Dandan1，XIAO Jing2

（1. Jinan Zhenglong Biological-Tech Co.，Jinan 250109，China；2. School of Bioengineering，Qilu University of Technology（Shandong Academy of Sciences），Jinan 250353，China）

Fish slurry is a by-product of fish meal processing，rich in protein and with a high viscosity．The enzymatic processing of fish slurry facilitates the hydrolysis of large molecules of protein into peptides and amino acids etc，which reduces the viscosity of the slurry，thereby improving its nutritional and processing transportability．The process conditions for the enzymatic digestion of fish slurry using ZL-1 were systematically investigated and optimised using single factor tests and orthogonal analysis．The optimum enzymatic conditions were obtained as follows，slurry concentration of 10%，temperature of 55 ℃，no pH adjustment，enzyme addition of ZL-1 at 0.75% dry matter concentration and enzymatic digestion time of 2 h．The validation of the optimum process conditions showed that the amino nitrogen content of the hydrolysate increased by 129.47% compared to the pre-optimisation period．The viscosity was reduced by 84.83% and the treatment of fish slurry with enzymes significantly increased their fluidity．

fish slurry；enzymatic；amino nitrogen

1007-9831（2022）08-0077-05

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.015

2022-05-06

王春曉（1990-），女，山東高密人，中級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事食品酶應(yīng)用研發(fā)研究．E-mail：jnyfzx002@163.com

肖靜（1974-），女，山東泰安人，教授，博士，從事酶制劑應(yīng)用研究．E-mail：xiaojing8168@163.com