王雪霏，曹哲，楊鑰，周馨瞳，王子郡，邵文杰，周子愷，徐佳璐，孟令波，鄭苗苗

北方黑土地花生根際叢枝菌根菌（AMF）分離鑒定及應(yīng)用

王雪霏1，曹哲1，楊鑰1，周馨瞳1，王子郡1，邵文杰1，周子愷1，徐佳璐2，孟令波1，鄭苗苗1

（1. 哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

采集黑龍江省種植花生區(qū)域的黑土土樣，通過(guò)濕篩法從花生根際土樣中分離純化出AMF菌孢子，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，獲得一株AMF菌，為株幼套球囊霉（），通過(guò)Single spore isolating方法完成AMF菌培養(yǎng)繁殖，孢子量350個(gè)/g，將獲得的純凈孢子接種到以花生為宿主植物的盆缽中，進(jìn)行擴(kuò)大繁殖．AMF菌能夠促進(jìn)花生根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，提高根系對(duì)N，P，K無(wú)機(jī)鹽離子的吸收，而且還具有抗倒伏作用，提高了花生產(chǎn)量，同時(shí)提高花生的油脂含量，能使花生中油脂含量提高2.3%～2.7％．

AMF菌；東北四粒紅花生；油脂

Arbuscular Mycorrhizal Fungi（AMF）菌是一種與植物根際共生關(guān)系的叢枝菌根真菌，主要包括木霉、球囊霉、地管囊霉等，能夠促進(jìn)植物根對(duì)N，P，K的吸收，對(duì)病毒、細(xì)菌均有抑制作用，對(duì)植物產(chǎn)生殺菌、抗菌、抗病、抗旱、抗寒、抗鹽堿等作用[1-4]．

AMF菌的主要作用是可改善植物的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，尤其是磷素營(yíng)養(yǎng)；可提高植物在極端環(huán)境中的抗逆性；有助于植物抵御病原菌的侵害；能改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)；促進(jìn)作物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效．AMF菌在農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)保護(hù)等方面具有重要意義[5-6]．AMF菌可以侵染植物根部與根部共生，進(jìn)而發(fā)揮其主要作用．AMF優(yōu)良菌株的分離篩選是AMF應(yīng)用技術(shù)中的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，一個(gè)優(yōu)良的菌種需要有遺傳方面的穩(wěn)定性，能有效侵染目標(biāo)植物，改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況或品質(zhì)；在與土著菌和病原菌等其它微生物的生存競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)，而且要具備適應(yīng)或抵抗不利和極端環(huán)境的能力[7-9]．

花生營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含油脂、各種維生素、亞油酸等，伴隨我國(guó)花生制品加工企業(yè)的快速發(fā)展，花生原料已經(jīng)不能滿足現(xiàn)有市場(chǎng)需求[10]．要解決當(dāng)務(wù)之急，就要從本質(zhì)上擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，提高花生產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量．其中最重要的是提高花生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，解決這一問(wèn)題的重要手段就是提高肥料功能和質(zhì)量[11-14]．

由于花生的各種營(yíng)養(yǎng)成分含量對(duì)花生加工企業(yè)的效益指標(biāo)影響甚大，因此，以花生作為原材料加工企業(yè)在收購(gòu)花生時(shí)一直都把營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量作為最主要的定價(jià)指標(biāo)，花生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低，使加工企業(yè)和花生種植戶的利益都受到了嚴(yán)重的沖擊[15]．不僅挫傷了農(nóng)民種花生的積極性，也造成了加工企業(yè)因缺少原料而導(dǎo)致開(kāi)工不足[7]109．因此，AMF菌能夠有效提高花生中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量是解決目前花生種植加工領(lǐng)域困境的主要辦法．本研究從花生根際土樣中分離純化出AMF菌孢子，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，獲得AMF菌株，通過(guò)Single spore isolating方法完成AMF菌擴(kuò)大繁殖．

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

花生根圍土樣15份，花生根系20根（黑龍江省雙城市杏山鎮(zhèn)農(nóng)田）．

Fungi Genomic DNA Extraction Kit基因組DNA提取試劑盒（Solarbio公司）；Qiagen凝膠回收試劑盒（Qiagen公司）；rTaq DNA聚合酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；dNTP，無(wú)水乙醇（天根生化科技有限公司）；蔗糖，維生素B6，維生素B1（哈爾濱邁科麥科技有限公司）；乙酰丁香酮（上海振品化工有限公司）；羧芐青霉素，磷酸二氫鉀（河北鵬與生物科技有限公司）；硫酸鉀，硫酸鋅，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鐵（山東騰飛生物科技有限公司）；肌醇（哈爾濱邁科麥科技有限公司）；煙酸（上海優(yōu)選生物科技有限公司）；甘氨酸（上海優(yōu)選生物科技有限公司）；Tris（北京博奧拓科技有限公司）；Agar（北京蘭杰柯科技有限公司）；氫氧化鈉（滄州劉氏化工有限公司）；冰醋酸（山東旭晨化工科技有限公司）；溴化乙錠（江蘇西格瑪電器有限公司）.以上試劑均為分析純．

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1土壤采集用鐵鍬除去土壤表層大塊顆粒，在近花生根際附近向下挖15～20 cm，將整株花生根系挖出，放入無(wú)菌自封袋中，用干冰保存，帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2AMF培養(yǎng)取保存土樣30 g，采用濕篩法從中篩選AMF菌孢子，在電子顯微鏡下觀察孢子數(shù)量，采用Single spore isolating方法挑選形態(tài)一致的孢子接種于花生植株根部，培養(yǎng)10～14周，獲得大量純凈AMF菌孢子．

1.2.3AMF菌擴(kuò)繁選取1～2 mm粒徑碎石和建筑河砂，按體積比1∶1混合，通過(guò)高壓蒸汽滅菌2～3h，冷卻，裝入消毒花盆中，取AMF菌孢子撒在花盆中，上面鋪一層碎石河砂，將已經(jīng)消毒的花生種子播種到花盆中，最后覆蓋一層碎石河砂，將盆栽置于溫室培養(yǎng)，定期澆灌，培養(yǎng)3～4個(gè)月，將收集的AMF菌攪拌到黑土和蛭石混合均勻的基質(zhì)中，種植花生，待花生成熟后，收集盆中土壤樣品，完成AMF菌的大量擴(kuò)繁．

1.3　AMF菌鑒定

采用徒手切片將花生的根用堿解離-酸性孔雀綠染色法處理，利用光學(xué)顯微鏡觀察侵染后的菌絲和孢囊．通過(guò)觀察孢子的形狀、大小、顏色等特征，并參照《真菌鑒定手冊(cè)》確定AMF菌的種屬[14]830．通過(guò)提取AMF菌孢子基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增18SrRNA基因片段，上游引物：5′-GTAGTTACATCGTTGACTC-3′，下游引物：5′-CTTGCGTCTACTCCGTTCAG-3′，得到的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)．

2　結(jié)果與分析

2.1　AMF菌形態(tài)觀察

花生根部橫切結(jié)果見(jiàn)圖1．由圖1可見(jiàn)，在花生根系中存在菌絲和孢囊結(jié)構(gòu)，且菌絲體侵染根外層細(xì)胞后還引起根系表面明顯隆起．因此，可以確定花生根際附近土壤中存在AMF菌．

圖1　花生根部橫切

2.2　AMF菌分子鑒定

AMF菌基因組DNA見(jiàn)圖2．由圖2可見(jiàn)，基因組DNA條帶清晰．在PCR擴(kuò)增中，獲得產(chǎn)物約1 300 bp DNA片段，條帶清晰且無(wú)其它雜質(zhì)存在，可以進(jìn)行測(cè)序（見(jiàn)圖3）．由生工生物工程股份有限公司測(cè)序得出有效序列長(zhǎng)度為890 bp．將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，AMF菌株與同源性最高，相似度為98%，并結(jié)合菌株AMF的形態(tài)觀察，可初步鑒定菌株AMF為叢枝菌根真菌．

圖2　AMF菌基因組DNA

圖3　PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3　AMF菌對(duì)花生根系形態(tài)及干物質(zhì)積累的影響

使用市售普通化肥（150 kg磷酸二氫鉀 + 75 kg尿素）按當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥，作為對(duì)照1．施加液體肥，稀釋150倍后澆灌至土壤，作為對(duì)照2．將制備的AMF菌顆粒與對(duì)照2混合，作為實(shí)驗(yàn)組．在不同處理下，花生的根系形態(tài)指標(biāo)方差分析結(jié)果見(jiàn)表1．由表1可見(jiàn)，在花生不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期中，總根長(zhǎng)度、根平均直徑、根表面積、根體積使用不同肥料處理，表現(xiàn)出不同程度的差異，且差異顯著（＜0.05），說(shuō)明花生根系受不同肥料影響較大．其中實(shí)驗(yàn)組在結(jié)莢期和成熟期總根長(zhǎng)度、根平均直徑、根表面積、根體積提高較明顯，促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)發(fā)育，提高干物質(zhì)累積量，增加產(chǎn)量．

表1　不同處理花生根部形態(tài)指標(biāo)方差分析

注：*表示在0.05水平顯著；**表示在0.01水平顯著．

不同處理花生在各生長(zhǎng)階段總根長(zhǎng)度、根平均直徑、根表面積、根體積、干物質(zhì)量情況見(jiàn)表2．由表2可見(jiàn)，不同生長(zhǎng)發(fā)育期總根長(zhǎng)度、根平均直徑、根表面積、根體積因使用不同的肥料而具有一定的差異，從苗期到結(jié)莢期不斷增加，總根長(zhǎng)度、根表面積在結(jié)莢期值最大，到了成熟期有下降；根平均直徑、根體積在成熟期還會(huì)繼續(xù)增加，在成熟期達(dá)到最大值．從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到，加入AMF菌的有機(jī)液體肥后，根體積增加較大，對(duì)花生植株抗倒伏能力的提高和固氮能力的增強(qiáng)具有重要作用．隨著不同生長(zhǎng)發(fā)育期干物質(zhì)積累也在緩慢增加，開(kāi)花期至結(jié)莢期增加顯著，呈上升趨勢(shì)，成熟期時(shí)達(dá)到積累最高峰．

表2　不同處理花生在各生長(zhǎng)階段總根長(zhǎng)度、根平均直徑、根表面積、根體積、干物質(zhì)量

注：數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，小寫字母表示0.05水平上差異顯著性．

數(shù)據(jù)表明，加入AMF菌的有機(jī)液體肥能夠促進(jìn)根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，提高根系對(duì)無(wú)機(jī)鹽離子的吸收，而且還具有抗倒伏作用，提高了花生產(chǎn)量．

2.4　AMF菌對(duì)花生根系吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響

2.4.1AMF菌對(duì)花生根系吸收N的影響不同處理花生在各生長(zhǎng)階段對(duì)N的吸收量見(jiàn)表3．由表3可見(jiàn)，花生從出苗到開(kāi)花期，對(duì)養(yǎng)分N的吸收較少，隨著花生生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，對(duì)N的吸收量逐漸增加，在成熟期達(dá)到高峰，占總量40%以上．從不同處理間的差異上看，苗期對(duì)N吸收總量：實(shí)驗(yàn)組>對(duì)照1>對(duì)照2，結(jié)莢期和成熟期對(duì)N吸收總量：實(shí)驗(yàn)組>對(duì)照2>對(duì)照1．結(jié)果表明，加入AMF菌液體肥比當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥、未加入AMF菌液體肥提高了花生根系對(duì)N的吸收量，AMF菌在施加一定量含N液體肥的基礎(chǔ)上促進(jìn)了花生的生長(zhǎng)，但施N量過(guò)高也會(huì)影響AMF菌的侵染．AMF菌促進(jìn)花生根系生長(zhǎng)，發(fā)達(dá)的根系與AMF菌形成共生關(guān)系，土壤中的AMF菌絲能夠促進(jìn)對(duì)液體肥中氨基酸的吸收，加速有機(jī)N的礦化，AMF的菌絲與花生的根系形成菌絲網(wǎng)絡(luò)，有效提高花生根部對(duì)N的吸收．

表3　不同處理花生在各生長(zhǎng)階段對(duì)N，P，K的吸收量

2.4.2AMF菌對(duì)花生根系吸收P的影響不同處理花生在各生長(zhǎng)階段對(duì)P的吸收量見(jiàn)表3．由表3可見(jiàn)，花生從出苗到開(kāi)花期，對(duì)養(yǎng)分P的吸收較少，隨著花生生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，對(duì)P的吸收量逐漸增加，在成熟期達(dá)到高峰，占總量42%以上．從不同處理間的差異上看，苗期、開(kāi)花期和成熟期對(duì)P吸收總量：實(shí)驗(yàn)組>對(duì)照2>對(duì)照1．結(jié)果表明，加入AMF菌液體肥比當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥、未加入AMF菌液體肥提高了花生根系對(duì)P的吸收量，AMF菌能夠促進(jìn)花生根對(duì)液體肥中P的吸收，提高花生產(chǎn)量．AMF菌在施加一定量含P液體肥的基礎(chǔ)上促進(jìn)花生的生長(zhǎng)，但施P量過(guò)高也會(huì)影響AMF菌的侵染．

2.4.3AMF菌對(duì)花生根系吸收K的影響不同處理花生在各生長(zhǎng)階段對(duì)K的吸收量見(jiàn)表3．由表3可見(jiàn)，花生在苗期對(duì)養(yǎng)分K的吸收量較少，不同處理下對(duì)K的吸收量?jī)H占總吸收量的5.93%～6.53%．在進(jìn)入開(kāi)花下針期，對(duì)K的吸收量迅速增加，整個(gè)開(kāi)花下針期對(duì)K吸收量占總量的50.16%～54.94%，為花生吸收K的最高峰時(shí)期．在結(jié)莢期和成熟期，吸收K的量逐漸減少，不同處理對(duì)K的吸收沒(méi)有明顯影響．加入AMF菌液體肥，能夠促進(jìn)花生根對(duì)液體肥中K的吸收，增加氣孔導(dǎo)度，提高花生的光合速率，顯著增加花生產(chǎn)量，尤其是花生中油脂的含量．

采用索式提取法測(cè)定對(duì)照1、對(duì)照2、實(shí)驗(yàn)組中花生油脂含量分別為18.35%，18.43%，18.85%．結(jié)果表明，加入AMF菌液體肥的油脂含量比當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥油脂含量提高了2.7%，加入AMF菌液體肥的油脂含量比未加入AMF菌液體肥油脂含量提高了2.3%．因此，加入AMF菌液體肥能夠顯著提高花生中油脂含量，進(jìn)而提高花生出油率．

3　結(jié)語(yǔ)

自發(fā)現(xiàn)AMF菌以來(lái)，人們對(duì)其分離篩選、形態(tài)、作用機(jī)理等領(lǐng)域進(jìn)行了深入研究，證實(shí)叢枝菌根真菌已經(jīng)與植物形成共生關(guān)系[15-16]，這些共生體對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、維持物質(zhì)循環(huán)和綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)具有深遠(yuǎn)意義．Alistair[17]等于2002年發(fā)現(xiàn)幾種新的菌株，自然界中被人們發(fā)現(xiàn)的AMF菌數(shù)量較少，大多數(shù)AMF菌的分類地位和生理特性尚不明確．

本研究在花生根系中發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)花生根際附近土壤篩選，獲得AMF菌孢子，進(jìn)行培養(yǎng)和大量擴(kuò)繁；通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)AMF菌菌絲和孢子特征與特征相似；通過(guò)對(duì)18S rRNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)AMF是．此外，有研究發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)植物對(duì)萜類化合物（甾醇、類胡蘿卜素、葉綠素、赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素）的積累，參與植物呼吸作用、光合作用并調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，在植物生命活動(dòng)中具有重要作用[18]．

AMF菌與液體肥混合施用時(shí)，可以與微量元素形成螯合物，增加微量元素向花生根部、葉部和其它部位運(yùn)轉(zhuǎn)的數(shù)量．調(diào)節(jié)常量元素與微量元素的比例，加強(qiáng)酶對(duì)糖分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、脂肪及各種維生素的合成運(yùn)轉(zhuǎn)[9]35．促進(jìn)酶的活性，使多糖轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，使淀粉、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、脂肪的合成積累增加，加速各種代謝初級(jí)產(chǎn)物從花生莖葉向根系輸送，提高花生塊根的產(chǎn)量，從而能夠使花生增產(chǎn)40%～70％的同時(shí)，改善花生的品質(zhì)．AMF菌還能減少無(wú)機(jī)化肥使用量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，可保護(hù)土壤水穩(wěn)性團(tuán)核結(jié)構(gòu)的形成，調(diào)節(jié)土壤pH、水、肥、氣、熱狀況，提高土壤的交換容量，增加花生對(duì)農(nóng)藥的抗藥性．AMF菌加入肥料中，比一般肥料利用率高，可以減少化肥用量，降低肥料投入，減少施用化肥對(duì)環(huán)境造成的污染，有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境．

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Isolation identification and application of inter-rhizosphere mycorrhizal fungi（AMF）from peanut in northern blackland

WANG Xuefei1，CAO Zhe1，YANG Yue1，ZHOU Xintong1，WANG Zijun1，SHAO Wenjie1，ZHOU Zikai1，XU Jialu2，MENG Lingbo1，ZHENG Miaomiao1

（1. School of Food Engineering，Harbin Institute，Harbin 150001，China；2. School of Dentistry，Harbin Medical University，Harbin 150001，China）

Black soil samples were collected from peanut growing areas in Heilongjiang Province，and AMF spores were isolated and purified from peanut inter-root soil samples by wet sieving method．According to morphological characteristics and molecular biology identification，one AMF strain was obtained as．The culture and reproduction of AMF was completed by single pore isolating method，and the spore amount was 350 pieces/g．The pure spores obtained were inoculated into a potted bowl with peanut as the host plant for expanded propagation．AMF can promote the elongation growth of peanut roots and improve the uptake of N，P and K inorganic salt ions by the roots．Moreover，it also has lodging resistance and improves peanut yield，at the same time，increasing the oil content of peanut can increase the oil content of peanut by 2.3%～2.7%．

AMF fungus；northeast four-grain red phlox；oil

1007-9831（2022）08-0071-06

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.014

2022-04-18

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210234053）；哈爾濱學(xué)院青年博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（HUDF2019103）；黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（LBH-Z18028）

王雪霏（2002-）女，黑龍江大慶人，在讀本科生．E-mail：2479435077@qq.com

鄭苗苗（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，教授，博土，從事應(yīng)用微生物研究．E-mail：miaomiao_0000@126.com