王大成，蘇鵬飛，賈會領，丁雙雙，黃勝威，闞文杰，姚緣圓，侯金艷，吳麗芳,4*

(1.安徽大學 物質(zhì)科學與信息技術研究院，安徽 合肥 230039；2.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院 離子束生物工程與綠色農(nóng)業(yè)研究中心，安徽 合肥 230031；3.中國科學技術大學 生命科學學院，安徽 合肥 230031；4.中科太和試驗站，安徽 太和 236626)

納米銀(silver nanoparticles，簡稱AgNPs)作為一種獨特的納米材料，由于其優(yōu)異的光電、催化及抗菌等性能，被廣泛應用于傳感器[1]、電極元件[2]、催化劑[3]、生物材料[4]及醫(yī)療抗菌[5]等領域.因此，人們開始關注AgNPs的合成.傳統(tǒng)的物理和化學方法合成AgNPs存在反應時間長、反應步驟繁瑣以及反應過程中存在有毒試劑的使用等缺陷[6].植物提取液合成AgNPs存在反應液制備過程復雜[7]、反應效率低等問題[8].由于通過微生物還原法即生物合成法合成AgNPs具有操作簡單、反應條件溫和、成本低廉以及綠色環(huán)保等優(yōu)點，被認為是AgNPs生產(chǎn)最具前景的來源[9].此外，利用生物合成方法合成的納米粒子表面很容易附著蛋白等生物基質(zhì)，在提高生物溶解性的同時提高了AgNPs的穩(wěn)定性，使其在生物醫(yī)學領域更具應用潛力[10].

目前，已分離出多種用于AgNPs合成的菌類[11-13]，由于細菌繁殖迅速而在AgNPs合成中脫穎而出[14].但AgNPs合成中亟需篩選1株硝酸銀耐受性強且合成效率高的菌株.筆者實驗室前期在松褐天牛腸道內(nèi)篩選到1株奇異變形桿菌(Proteusmirabilis) YC801，研究發(fā)現(xiàn)此株奇異變形桿菌能夠高效合成納米硒[15]，并初步證實該菌株具有高效合成AgNPs的能力.由于細菌胞外濾液相比于全細胞而言無細胞結(jié)構等，用于合成AgNPs不僅操作簡單、易于分離，且具有較高的回收效率和產(chǎn)量等優(yōu)勢.

目前，AgNPs作為植物生長調(diào)節(jié)劑在植物快繁方面表現(xiàn)出越來越多的積極作用，Manh等[16]研究發(fā)現(xiàn)1.6 mg·mL-1AgNPs可顯著提高越南參體細胞胚的發(fā)生和增殖，Spinoso-Castillo等[17]研究表明,在香蘭草的組培快繁中，低劑量AgNPs的使用既能抑制微生物污染又能通過提高葉綠素含量、總酚含量,抵抗氧化及脂質(zhì)過氧化能力來促進幼苗生長.此外，AgNPs在草莓組培快繁體系中能顯著提高芽增殖率和不定根誘導率[18].目前，AgNPs對植物生長的研究主要集中在AgNPs對植物抗氧化酶系統(tǒng)的影響[19]及抑制乙烯通路[20]等方面，而在光合作用方面鮮有報道.眾所周知，光合作用是植物生命活動中一項重要的生理生態(tài)過程，植物生物量的積累離不開光合作用.葉綠素作為植物光合色素中一類重要色素，其含量高低以及最大光化學效率Fv/Fm的大小可作為評判植物光合能力強弱的重要指標[21].

楊樹(PopulusL.)作為我國重要的材用樹種，在綠化及防風固沙方面也具有重要作用.通過組培方式對其進行快繁，在楊樹種苗規(guī)?；茝V及遺傳改良方面起著舉足輕重的作用.目前，有關AgNPs對楊樹組培苗生長影響方面的研究尚未有報道.筆者以奇異變形桿菌YC801合成AgNPs為主要研究內(nèi)容，探究菌培養(yǎng)時間、銀離子濃度、反應溫度、反應時間，以及pH等對菌液上清合成AgNPs的影響.在AgNPs合成的基礎上，進一步研究AgNPs對楊樹組培苗不定根形成、光合能力等的影響.

1 材料和方法

1.1 供試材料

菌株：所用菌株奇異變形桿菌(Proteusmirabilis) YC801為筆者實驗室保藏(NCBI注冊號為MK701741).所用培養(yǎng)基為YEP固體培養(yǎng)基和YEP液體培養(yǎng)基.

楊樹組培苗：以筆者課題組前期離體再生培養(yǎng)獲得的長勢均一的無性系84K楊樹組培伸長不定芽為實驗材料.所用基本培養(yǎng)基為1/2 MS固體培養(yǎng)基(6.8 g·L-1瓊脂、20 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基皆用1 N NaOH或1 N HCl將pH調(diào)整至5.8，于121 ℃，105 kPa條件下高壓蒸汽滅菌20 min后，備用).

1.2 主要試劑和儀器

硝酸銀(AgNO3)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；吲哚丁酸(IBA), 美國Sigma Aldrich；超微量生化分光光度計(Scandrop)，德國Analytik Jena AG；掃描電子顯微鏡(S4800), 日本日立；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES, ICP 7400), 美國 Thermo Scientific；葉綠素計(SPAD-502 PLUS), 日本柯尼卡美能達；手持式光譜儀(SpectraPen LM 510)、手持式葉綠素熒光儀(Fluorpe FP 110)，捷克 PSI.

1.3 AgNPs的生物合成及條件優(yōu)化

研究涉及的AgNPs生物合成過程主要包括以下步驟：(1)奇異變形桿菌YC801的活化.將超低溫冰箱(-80 ℃)保存的YC801菌株于YEP固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落，接種到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩過夜培養(yǎng).(2)制備菌液上清.將新鮮菌液按1%(v/v)接種到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；將培養(yǎng)的菌液進行離心(12 000 r·min-1，15 min)獲得上清.(3)AgNPs的合成.將AgNO3溶液加入菌液上清中并均勻混合，避光下水浴恒溫反應，得到紅棕色反應液，將所得反應液進行低速離心(3 000 r·min-1，2 min)，去除雜質(zhì)后用高速低溫冷凍離心機進行離心(12 000 r·min-1，20 min)，然后用pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗3次，最后加入0.3% PVP溶液穩(wěn)定AgNPs顆粒，即得到AgNPs溶液.

為了探究不同培養(yǎng)時間對AgNPs合成的影響，將YC801菌株分別培養(yǎng)不同時間(8，12，16，20，24，28 h)，然后在上述合成步驟(1)和步驟(3)不變的條件下進行AgNPs的合成.在此基礎上，為優(yōu)化不同銀離子濃度對AgNPs合成的影響，在其他條件不變的前提下，探究不同AgNO3濃度(0，1，3，5，7，10 mmol·L-1)對AgNPs合成的影響.為研究不同溫度對AgNPs合成的影響，實驗中進一步將水浴溫度分別設置為25，40，55，70，85，100 ℃，在其他條件不變的前提下進行AgNPs的合成.為評價不同pH對AgNPs合成的影響，菌液上清的pH由碳酸鈉和稀硝酸分別調(diào)節(jié)至6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，在其他條件不變的情況下，按上述方法合成AgNPs.同時，進一步研究100 ℃水浴不同孵育時間(3，5，7，10，15，20 min)對AgNPs合成的影響.

將在上述最優(yōu)培養(yǎng)條件所得的YC801菌株的菌液，最優(yōu)AgNO3濃度、pH、反應溫度及孵育時間等條件下合成的AgNPs，高速離心(12 000 r·min-1，20 min)后用pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗3次，最后加入0.3% PVP溶液穩(wěn)定AgNPs顆粒，得到AgNPs溶液.

1.4 AgNPs的表征

掃描電子顯微鏡(TEM)：取適量最優(yōu)條件下合成的AgNPs溶液，超聲振蕩30 min，移液適量AgNPs在銅網(wǎng)上，晾干，重復幾次后獲得樣品.在掃描電子顯微鏡下觀察AgNPs的形貌及尺寸.

電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)：將最優(yōu)條件下制備的AgNPs溶液稀釋1倍，用0.22 μm濾膜過濾，此即是AgNPs母液，過濾后的AgNPs溶液置于4 ℃冰箱備用.取50 μL AgNPs母液加入4 950 μL濃硝酸，過夜硝化，蒸干溶液后加入5 mL超純水，0.22 μm濾膜過濾后用ICP 7400電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定AgNPs濃度.

1.5 不同濃度AgNPs對楊樹組培苗生長的影響

為了進一步探究AgNPs對楊樹組培苗生長的影響，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加AgNPs母液使其終濃度分別為0.00，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 mg·L-1進行預實驗.將長勢均一的高度為2 cm左右的楊樹組培不定芽分離成單個芽體后接種于不同濃度的AgNPs培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶放置于溫度為(23 ± 2) ℃，光照強度為2 000～2 500 lx，光照周期為16/10 h(光照/黑暗)的恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)4周后去除楊樹組培苗基部的培養(yǎng)基，觀察并統(tǒng)計再生植株的株高、不定根長、不定根數(shù)及側(cè)根數(shù).

1.6 不同外源處理對楊樹組培苗生長的影響

在前期的預實驗中，研究發(fā)現(xiàn)以IBA作為外源植物生長調(diào)節(jié)劑時，其濃度為0.5 mg·L-1時最有利于楊樹組培苗的生根.因此，實驗采用0.5 mg·L-1IBA與AgNPs做對比.以上述實驗中不同濃度AgNPs處理的楊樹伸長芽獲得的最佳促生長的AgNPs濃度為1.0 mg·L-1，選取長勢一致的楊樹組培苗，分別接種于4組不同外源處理培養(yǎng)基中：(1)對照組(CK)——以1/2 MS為基本培養(yǎng)基；(2)AgNPs組——以1/2 MS為基本培養(yǎng)基 + 1.0 mg·L-1AgNPs；(3)IBA組——以1/2 MS為基本培養(yǎng)基 + 0.5 mg·L-1IBA;(4)IBA-AgNPs組——以1/2 MS為基本培養(yǎng)基 + 1.0 mg·L-1AgNPs+0.5 mg·L-1IBA培養(yǎng).每個處理設置4個生物學重復，每個重復處理5瓶楊樹伸長芽，每瓶接種4個.將接種有楊樹伸長芽的培養(yǎng)瓶放置于溫度為(23 ± 2) ℃，光照強度為2 000～2 500 lx，光照周期為16/10 h(光照/黑暗)的恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)5周后觀察各處理組楊樹伸長芽的生長狀況.

(1)取組培苗在流動水下洗凈附著在楊樹苗基部的瓊脂，擦干水分后，測量株高和不定根長，并記錄不定根數(shù)和側(cè)根數(shù).(2)根系活力測定：按照北京雷根生物技術有限公司植物根系活力試劑盒(TCC比色法)測定各處理組楊樹苗的根系活力.(3)葉綠素相對含量測量：使用葉綠素計(SPAD-502 PLUS)直接夾取葉片檢測其葉綠素相對含量SPAD.(4)使用SpectraPen LM 510手持式光譜儀檢測培養(yǎng)的光照強度，光照強度的數(shù)據(jù)將應用于葉綠素熒光儀測試參數(shù)的設定；Fluorpe FP 110手持式葉綠素熒光儀測量葉綠素熒光相關指標，記錄PS II的最大光化學效率Fv/Fm.

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為3次獨立測定的測量值的平均值，并表示為平均值 ± 標準誤差，使用Origin 2021軟件作圖，同時運用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，采用Ducan’s檢驗分析在0.05水平上的顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs的生物合成

紫外可見吸收光譜技術被認為是研究納米材料制備過程的重要技術之一，且相關研究表明AgNPs水溶液為紅褐色或灰棕色[22-24].該研究中YC801上清反應過程中由淡黃色變?yōu)榧t褐色，研究結(jié)果表明Ag+向AgNPs轉(zhuǎn)化(圖1).這種顏色變化是由于在反應體系中合成的AgNPs顆粒表面等離子體共振(SPR)引起的.紫外吸收光譜顯示AgNPs在430 nm(圖2)左右有最大吸收峰，研究結(jié)果與前人研究的AgNPs紫外吸收光譜在400～450 nm保持一致[25-26].

圖1 AgNPs合成前后溶液的顏色變化 圖2 AgNPs的UV-Vis圖

2.2 AgNPs的條件優(yōu)化

不同培養(yǎng)時間(8，12，16，20，24，28 h)培養(yǎng)的奇異變形桿菌的菌液對AgNPs合成的影響，結(jié)果如圖3(a)所示.前人研究表明，在AgNPs合成反應體系中初始銀離子濃度對AgNPs的形狀和大小都有較大的影響[27].為進一步優(yōu)化銀離子濃度，采用不同濃度的AgNO3與菌液上清反應，不同濃度的AgNO3對AgNPs合成的影響結(jié)果如圖3(b)所示.

(a)YC801的培養(yǎng)時間對AgNPs合成的影響在反應顏色上的變化及UV-Vis圖；(b)銀離子濃度對AgNPs合成的影響在反應顏色上的變化及UV-Vis圖.圖3 AgNPs合成條件優(yōu)化

通過顏色(圖3(a))觀察發(fā)現(xiàn)，隨著YC801培養(yǎng)時間的增加，反應體系的顏色逐漸加深.相應的UV-Vis圖顯示當菌培養(yǎng)8 h時，在360～700 nm波長范圍內(nèi)，沒有出現(xiàn)特征吸收峰；而當菌培養(yǎng)時間在12～28 h范圍內(nèi)菌液均能合成AgNPs，且在培養(yǎng)24 h時特征峰達到最大.相關研究表明特征吸收峰值的大小與溶液中AgNPs顆粒的濃度呈正比關系[23]，由此可知，在24 h時合成的AgNPs濃度最大.進一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著菌培養(yǎng)時間的延長，吸收峰發(fā)生了藍移，可推測這一轉(zhuǎn)變是由于銀離子快速被還原，同時也說明了奇異變形桿菌在培養(yǎng)過程中隨著時間的延長，還原Ag離子的代謝產(chǎn)物先增加后減少，這對AgNPs的生產(chǎn)有重要的指導意義.

圖3(b)顯示，隨著銀離子濃度的增加，反應體系的顏色逐漸加深.而相應的UV-Vis顯示較低濃度的Ag+反應體系在360～700 nm范圍內(nèi)無明顯特征吸收峰，由此證明反應體系中無AgNPs的合成，當AgNO3濃度為10 mmol·L-1時，合成的AgNPs特征峰值對應最大，即此時AgNPs含量最高.

由于反應溫度是影響AgNPs形狀和大小的關鍵因素之一，將水浴溫度分別設置為25，40，55，70，85，100 ℃，研究水浴溫度對AgNPs合成的影響，結(jié)果如圖4(a)所示.pH的改變導致代謝物質(zhì)中的電荷轉(zhuǎn)換，堿性pH易引發(fā)金屬離子的溶解，從而改變合成物的大小和形態(tài)[28]，結(jié)果如圖4(b)所示.為研究反應時間對AgNPs合成的影響，分別記錄在水浴溫度為100 ℃時，分別孵育3，5，7，10，15，20 min對AgNPs合成的影響，結(jié)果如圖4(c)所示.

(a)溫度對AgNPs合成的影響反應顏色變化及UV-Vis圖；(b)反應時間對AgNPs合成的影響反應顏色變化及UV-Vis圖；(c)pH對AgNPs合成的影響影響反應顏色變化及UV-Vis圖.圖4 AgNPs合成條件優(yōu)化

結(jié)果表明(圖4(a))，在較低溫度下溶液顏色轉(zhuǎn)變較小，在25 ℃時未檢測到特征峰出現(xiàn)，表明此時反應體系中無AgNPs形成.在較高溫度下形成AgNPs的時間更短，效率更高.此外，AgNPs也能在室溫下形成，但速度緩慢，而且SPR帶較之高溫條件相比不尖銳，即合成效率較低[29].

不同pH體系所對應的UV-Vis(圖4 (b))顯示，在pH=6.0時，無特征吸收峰出現(xiàn)，表示無AgNPs顆粒生成，且隨著pH的增加，特征吸收峰值逐漸增加，在pH=10.0時得到最大的特征峰，此時的AgNPs含量最高.而在pH=11.0時峰值又開始下降，推測可能是由于堿性過高，對菌液上清中的有機物質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，進而影響了合成的效率[30].

圖4 (c)顯示，隨著反應時間的增加，反應溶液的顏色越來越深，但水浴時間為15 min時開始有少許沉淀，到20 min時沉淀變多.相應的UV-Vis顯示，在反應3 min時即有AgNPs產(chǎn)生，在反應3～15 min內(nèi)AgNPs的特征峰越來越高，表明AgNPs的濃度越來越高，但在20 min時峰值又急劇下降，SPR吸收急劇下降，AgNPs濃度降低，可能是由于反應時間過長，AgNPs和蛋白等有機質(zhì)一起團聚沉淀，因而其含量下降[7].因此，選擇在100 ℃水浴孵育10 min為最佳反應時間.

綜上所述，最優(yōu)條件下的合成路線為：將培養(yǎng)24 h的YC801菌株的菌液上清加入10 mmol·L-1的AgNO3溶液中，于pH=10，反應溫度為100 ℃條件下孵育10 min合成AgNPs，然后將合成的AgNPs高速離心(12 000 r·min-1，20 min)后用pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗3次，最后加入0.3% PVP溶液穩(wěn)定AgNPs顆粒，得到AgNPs溶液.

2.3 AgNPs的表征

利用SEM 對AgNPs的形貌進行表征，結(jié)果顯示菌液上清合成的AgNPs主要為球形或偽球形，納米顆粒尺寸均勻，分散性良好且無明顯的團聚現(xiàn)象(圖5(a)).使用粒徑分析軟件分析顆?？芍?，合成的AgNPs顆粒尺寸為20～60 nm(圖5(b)).

進一步采用ICP 7400電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定AgNPs濃度，得到AgNPs母液濃度為0.848 4 mg·mL-1.

圖5 AgNPs的SEM(a)和粒徑分布圖(b)

2.4 不同濃度AgNPs對楊樹組培苗生長的影響

添加不同濃度AgNPs的培養(yǎng)基培養(yǎng)4周后的組培苗的株高、不定根長和不定根數(shù)及側(cè)根數(shù)如表1和圖6所示.當培養(yǎng)基中AgNPs濃度小于2.0 mg·L-1時，隨著AgNPs濃度的增加，楊樹組培苗的株高逐漸增加，最高可達68.0 9 mm，較CK(47.30 mm)顯著增加了43.95%.當培養(yǎng)基中AgNPs濃度為1.0 mg·L-1時，不定根長度為41.83 mm，較CK(29.37 mm)顯著增長42.42%.當培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1AgNPs時，平均側(cè)根數(shù)最多，為42條，較CK(15條)顯著增加了182.2%.當AgNPs達到2.0 mg·L-1后，楊樹組培苗的各項生長指標都有不同程度的下降，開始出現(xiàn)AgNPs對植物的毒性效應，這與前人的研究結(jié)果一致[31-33].綜上所述，AgNPs處理的楊樹組培苗在株高、不定根長和側(cè)根數(shù)以及長勢上都表現(xiàn)出較好的形態(tài).可以推測一定濃度范圍內(nèi)的AgNPs能夠有效促進楊樹組培苗的生長.

表1 不同濃度AgNPs對楊樹組培苗生長的影響

圖6 不同濃度AgNPs對楊樹組培苗生長的影響

2.5 不同外源處理對楊樹組培苗生長的影響

在探究了不同濃度AgNPs對楊樹組培苗生長影響的基礎上，進一步進行在最適濃度(1.0 mg·L-1)AgNPs與最適濃度IBA(0.5 mg·L-1)之間的對比實驗，溫室培養(yǎng)5周后組培苗的生長情況如表2、圖7所示.

表2 不同外源處理對楊樹組培苗生長的影響

圖7 不同外源處理對楊樹組培苗生長的影響

與CK比較，3個處理組對楊樹組培苗高的生長都有不同程度的促進，尤其是AgNPs處理組明顯較其他組別形態(tài)好(圖7).表2顯示，各處理組的株高較CK組均有顯著差異，其中AgNPs組(120.53 mm)相比CK組提高了36.67%，而IBA組(106.07 mm)比CK組(88.19 mm)提高20.27%.在不定根長度上AgNPs組(66.59 mm)較CK組(45.71 mm)顯著增加了45.68%，較IBA組(53.11 mm)也提高了25.38%.進一步研究發(fā)現(xiàn)，各組別與CK相比較在不定根數(shù)量上也有顯著的提高.在側(cè)根的誘導方面，AgNPs組表現(xiàn)出了絕對優(yōu)勢，較CK組顯著增加了86.87%，而AgNPs和IBA聯(lián)合使用，則沒有出現(xiàn)協(xié)同作用.

植物生長發(fā)育所需的水分和無機養(yǎng)分主要通過根系吸收，根的生長情況和活力水平直接影響地上部分的生長和營養(yǎng)狀況及生物量積累，根系活力是衡量其吸收能力的主要指標，它在一定程度上反映了植物的生命活動和新陳代謝的強弱[34].如圖8所示，其他不同外源處理間楊樹組培苗的根系活力存在顯著差異，以AgNPs組最高，較其他處理組分別增加7.90%(IBA-AgNPs)，35.76%(IBA)，42.69%(CK).表明AgNPs能顯著提升楊樹幼苗根系活力.

不同小寫字母(a，b，c)表示不同外源處理之間存在顯著性差異(p<0.05)；相同字母表示無顯著性差異.圖8 不同外源處理對楊樹根系活力的影響

納米粒子與植物體之間的相互作用十分復雜，不僅取決于納米材料的理化特性、試驗濃度，也取決于植物種類、生長階段或其他介質(zhì)，還與光照強度、植物體暴露途徑等因素息息相關[35].納米粒子可以通過滲入細胞對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響.AgNPs對植物生長的調(diào)控機制目前并不是很清楚，已有研究推測AgNPs是通過改變細胞壁來增強植物細胞對養(yǎng)分的吸收[36].同樣在其他納米材料對植物的影響中也有類似的結(jié)論，Khodakovskaya等[37]利用TEM發(fā)現(xiàn)納米碳能進入番茄幼苗的根系，并提高根系的吸水吸肥能力.Servin等[38]研究表明添加TiO2NPs溶液能夠促進黃瓜對P，K 等養(yǎng)分的吸收和根系的生長.筆者的研究結(jié)果顯示，AgNPs對楊樹組培苗的生長指標以及根系活力等都有顯著的提升，證明了AgNPs在促進植物生長方面的積極作用.

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，葉綠素含量與光合性能密切相關.研究結(jié)果(圖9(a))表明，外源添加AgNPs對比其他處理組的SPAD值有顯著性差異，其中比CK組提高了17.66%，這與前人報道一致[16]，即AgNPs濃度在0.4～1.6 mg·L-1范圍內(nèi)有促進人參SPAD值增加的效果，同時促進了植株的生長.以Fv/Fm值作為光系統(tǒng)II(PS II)效率的指標來表示楊樹光合作用強度.由圖9(b)可知，AgNPs組與其他處理組都有顯著性差異，其中AgNPs組較CK組提高了5.33%.表明AgNPs對提升楊樹組培苗光合效率有著明顯的效果，而添加外源IBA的處理組，則沒有顯著提高其光合效率.然而，IBA-AgNPs復合處理并沒有出現(xiàn)協(xié)同效應.

不同小寫字母(a，b，c)表示不同外源處理之間存在顯著性差異(p<0.05)；相同字母表示無顯著性差異.圖9 不同外源處理對楊樹SPAD(a)和光合效率(b)的影響

在組培過程中，由于植物在密閉的容器中培養(yǎng)，包括乙烯等有害氣體的不斷積累可能會影響其生理代謝[39].研究表明，ACS基因是乙烯合成通路中的限速酶，AgNPs通過抑制ACS基因的表達而減少乙烯的釋放[40-41].Young等[42]在ZmACS6缺陷型玉米植株的葉片中，觀察到更高水平的葉綠素和蛋白質(zhì)以及更高的CO2同化速率，表明乙烯可以作為負調(diào)節(jié)劑來控制葉片中的葉綠素含量.研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs處理離體小麥和甜菜幼苗時，都顯著提高了葉綠素含量[43-44].另外，AgNPs處理后葉綠素含量的增加也可能與植物組織中氮、鐵、鎂含量的吸收增加有關[17].筆者的實驗結(jié)果表明，AgNPs處理在葉綠素相對含量SPAD及最大光化學效率方面都有顯著提升，促進了植株生長.但AgNPs與植物之間的相互作用還需進一步深入研究.

3 結(jié)束語

筆者在前期研究的基礎上，進一步探究了奇異變形桿菌培養(yǎng)時間、反應時間、反應溫度和AgNO3溶液濃度及pH對菌株胞外上清合成AgNPs的影響.在AgNPs條件優(yōu)化的基礎上，對合成的AgNPs進行了表征.最后，以楊樹組培苗為研究對象探究了AgNPs對其不定根形成、根系活力及其生長的影響.

(1) AgNPs合成的最優(yōu)條件為：以培養(yǎng)24 h的奇異變形桿菌YC801菌液上清與濃度為10 mmol·L-1AgNO3溶液在100 ℃、pH 10的條件下混合反應10 min.

(2) AgNPs合成具有高效性：在最優(yōu)條件下3 min即開始合成AgNPs，濃度最大可達0.848 4 mg·mL-1，所合成AgNPs在430 nm左右有特征吸收峰，其顆粒呈球形或偽球形，分散性良好，粒徑分布在20～60 nm.

(3) 楊樹組培苗在添加1.0 mg·L-1AgNPs的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，其株高、不定根長、側(cè)根數(shù)、根系活力以及形態(tài)上都表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢.AgNPs處理顯著提高了楊樹葉綠素含量及光合效率.研究結(jié)果表明，綠色合成的AgNPs在植物組培快繁中具有潛在的應用價值.