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        初探eDNA在貴州草海入侵種克氏原螯蝦監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

        2022-09-02 06:51:56韓德科金志梅
        關(guān)鍵詞:草海濾膜克氏

        韓德科,李 青,楊 欽,金志梅

        (貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院;貴州省普通高等學(xué)校生物資源開發(fā)與生態(tài)修復(fù)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 畢節(jié) 551700)

        我國(guó)東部沿海和西南地區(qū)地貌和氣候類型多樣,生物的多樣性比較豐富,然而本區(qū)域也是遭受外來(lái)物種入侵最嚴(yán)重的地區(qū)之一。外來(lái)物種入侵是導(dǎo)致生物多樣性喪失的重要原因之一。由于多數(shù)外來(lái)物種在入侵新領(lǐng)地的初期種群密度比較低,通常不易引起人們的關(guān)注。如果該時(shí)期不加以有效控制,種群密度會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)散,逐漸形成當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)種群,嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)乇就廖锓N的存活,引發(fā)生物多樣性的喪失,造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。由此可見,外來(lái)物種入侵新領(lǐng)地的初期是進(jìn)行有效防控的最佳時(shí)機(jī),對(duì)該時(shí)期入侵物種的分布監(jiān)測(cè)、預(yù)警和應(yīng)急處理對(duì)于有效防控外來(lái)物種入侵新領(lǐng)地至關(guān)重要。

        克氏原螯蝦,俗稱小龍蝦,屬節(jié)肢動(dòng)物門,甲殼綱,十足目,蝲蛄科,原螯蝦屬。原產(chǎn)于美洲,營(yíng)養(yǎng)豐富,味道鮮美,是當(dāng)?shù)胤浅V匾臐O業(yè)資源之一。20世紀(jì)30年代,小龍蝦從日本傳入中國(guó)。近年來(lái),隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展和市場(chǎng)需求量的不斷擴(kuò)大,小龍蝦在中國(guó)的分布已經(jīng)從最初的長(zhǎng)三角地區(qū)擴(kuò)散至華北、華中和華南等地。小龍蝦是典型雜食性動(dòng)物,繁殖能力強(qiáng),具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,可以在多種多樣的淡水生態(tài)環(huán)境及一些極端環(huán)境中存活。小龍蝦喜好在夜間進(jìn)行覓食活動(dòng),常棲息在水體底層,挖掘洞穴。小龍蝦的入侵能力極強(qiáng),一旦入侵新領(lǐng)地,將嚴(yán)重危及該地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中水生植物、兩棲動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的存活,影響入侵地生物的多樣性[1]。

        草海是國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),全球十大最佳濕地觀鳥區(qū)之一,素有“高原明珠”之稱。近年來(lái)入侵種小龍蝦在草海出現(xiàn),甚至在局部泛濫成災(zāi)。準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)小龍蝦在草海的分布現(xiàn)狀和擴(kuò)散動(dòng)態(tài)是有效防控小龍蝦成功入侵的基礎(chǔ)。目前常用的監(jiān)測(cè)方法主要是依靠蝦籠誘捕,該方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且由于在小龍蝦入侵初期,種群數(shù)量比較低,得到的數(shù)據(jù)不夠準(zhǔn)確。環(huán)境DNA(Environmental DNA,eDNA)指存在于生物體細(xì)胞核或線粒體中的DNA,通過(guò)生物體分泌的粘液、糞便、毛屑、配子體等釋放到環(huán)境中的DNA片段。eDNA技術(shù)指從環(huán)境樣本中提取DNA后進(jìn)行測(cè)序分析的方法,由于該技術(shù)具有耗時(shí)短、成本低及靈敏度高等特點(diǎn),近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物生物量評(píng)估和監(jiān)測(cè)。然而,在不同類型棲息地中,eDNA的時(shí)間和空間分布特點(diǎn)不同,且不同物種由于其生活習(xí)性的不同,釋放到環(huán)境中的DNA也不同[2-4]。本研究采用eDNA技術(shù)對(duì)草海入侵物種克氏原螯蝦進(jìn)行調(diào)查,一方面,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)克氏原螯蝦,利用qPCR檢測(cè)水樣中的eDNA,繪制種群密度—eDNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,探究eDNA技術(shù)所能檢測(cè)的定性和定量的最低DNA濃度,建立一套適于克氏原螯蝦的eDNA技術(shù)操作流程,為草海克氏原螯蝦分布監(jiān)測(cè)提供一種新的方法。另一方面,同時(shí)采用傳統(tǒng)的蝦籠誘捕法進(jìn)行監(jiān)測(cè),比較eDNA技術(shù)和傳統(tǒng)的蝦籠陷阱法的調(diào)查結(jié)果是否一致,從而為進(jìn)一步有效防控克氏原螯蝦入侵草海、威脅草海生物多樣性奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 特異性引物設(shè)計(jì)與qRT-PCR

        在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索克氏原螯蝦線粒體細(xì)胞色素酶氧化亞基Ⅰ(COI)基因序列,根據(jù)序列,利用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物,并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行引物特異性檢測(cè)。確定的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。25μL反應(yīng)體系如下:12.5μL SYBR Premix Ex Taq TMⅡ,1μLDNA模板,正反引物(10mmon/L)各1μL,ddH2O 9.5μL。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s,60℃退火20s,45個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

        1.2 克氏原螯蝦組織DNA提取及PCR擴(kuò)增

        2018年8月在草海市場(chǎng)購(gòu)買克氏原螯蝦,取其肌肉組織,液氮冷凍,-80℃保存。傳統(tǒng)酚-氯仿-異戊醇法提取肌肉組織DNA,將提取的DNA溶液稀釋至50 ng/μL。PCR25 μL體系:10*Taq Buffer 2.5 μL,dNTPs 0.5 μL,正反引物(10mmon/L)各0.5 μL,Taq DNA Polymerase 0.5 μL,模板DNA1 μL,MgCl21.5 μL,ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃復(fù)延伸10 min。

        1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

        使用純化試劑盒(Gel Extraction Kit)純化PCR產(chǎn)物,與pMD-18-T質(zhì)粒連接,將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,冰浴30 min,42℃熱激1 min,加入液體培養(yǎng)基在37℃搖床振蕩培養(yǎng)2 h,取150 μL菌液涂于含Amp、X-gal和IPTG的LB固體平板培養(yǎng)基,37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落置于1.5 mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),將菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,選取成功連接的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)。使用Plasmid Mini Kit試劑盒提取質(zhì)粒DNA,利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度,用ddH2O將其稀釋10-109倍,分別以稀釋后DNA為模板,每個(gè)濃度樣本做三個(gè)重復(fù),通過(guò)qRT-PCR技術(shù)獲得每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的Ct值(表示定量PCR的循環(huán)數(shù)的閾值)。

        1.4 eDNA樣品的采集與提取

        2019年7-9月在草海水域的周邊隨機(jī)選取15個(gè)采樣點(diǎn)(S1-S15),進(jìn)行采樣,由于草海水體中藻類雜質(zhì)較多,可能會(huì)堵塞過(guò)濾膜的濾孔,因此,在膜過(guò)濾水樣之前,首先用10 μm孔徑的金屬過(guò)濾網(wǎng)預(yù)過(guò)濾。預(yù)處理后,將獲得的水樣裝入滅菌過(guò)的塑料容器中,冰盒(4℃)和室溫(RT)兩種方式保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。膜過(guò)濾使用的是配套的PALL電動(dòng)泵和300 mL一次性的濾杯。在過(guò)濾過(guò)程中,對(duì)比了不同孔徑(0.45 μm,0.8 μm,1.2 μm和5.0 μm)硝酸纖維膜,過(guò)濾不同體積(150 mL,300 mL,500 mL,1000 mL和2000 mL)水樣,不同保存方法(4℃和RT)和儲(chǔ)存不同時(shí)間(4 h,8 h,32 h,56 h和80 h)對(duì)eDNA富集的影響。具體過(guò)濾過(guò)程如下:使用已滅菌的500 mL燒杯舀取水樣導(dǎo)入PALL一次性濾杯中,使用PALL電動(dòng)泵過(guò)濾水樣;每組處理重復(fù)三次,待水樣過(guò)濾完后,用滅菌的鑷子將濾膜折疊,放入含有無(wú)水乙醇保存液的離心管中,要確保濾膜能完全浸沒于保存液中;將濾膜放置干冰中保存,待提取DNA。

        利用DNeasy Power Water DNA Kit試劑盒提取eDNA。將濾膜取出解凍后,用剪刀將濾膜剪成細(xì)條狀,放入2 mL離心管中,具體操作參照說(shuō)明書。提取完成后,使用Nano Drop檢測(cè)提取DNA的濃度與純度。

        1.5 eDNA濃度與克氏原螯蝦種群密度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        在草海周邊購(gòu)買克氏原螯蝦帶回實(shí)驗(yàn)室,分為5組,每組5只,放入5個(gè)滅菌后的聚乙烯材質(zhì)的長(zhǎng)方形裝有5 L自來(lái)水的水槽中飼養(yǎng),模擬自然生長(zhǎng)條件下1只/L克氏原螯蝦的eDNA濃度;此外,設(shè)置兩個(gè)不放克氏原螯蝦的空白對(duì)照組。飼養(yǎng)5天后,采集水槽中水樣,方法如野外采樣。將實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)克氏原螯蝦水樣分別稀釋成:1只/L,1只/10 L,1只/100 L,1只/1000 L,1只/10000 L和1只/100000 L,qRT-PCR檢測(cè)不同濃度對(duì)應(yīng)克氏原螯蝦eDNA濃度,繪制克氏原螯蝦eDNA濃度與克氏原螯蝦種群密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.6 傳統(tǒng)蝦籠法實(shí)驗(yàn)

        在每塊樣地采集水樣后,在每個(gè)蝦籠(長(zhǎng)30 cm,寬15 cm,高15 cm)中加入10 g餌料,然后放置在樣地中,經(jīng)過(guò)24 h小時(shí)后,于次日回收,統(tǒng)計(jì)鋪?zhàn)降降目耸显r數(shù)量。

        1.7 數(shù)據(jù)處理

        草海水樣中克氏原螯蝦eDNA濃度按eDNA-Ct標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差copies/μL表示。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn),然后使用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行繪圖。

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.1 提取DNA質(zhì)量檢測(cè)

        提取的克氏原螯蝦肌肉組織DNA純度及濃度均較高,且電泳PCR產(chǎn)物條帶單一。表明COⅠ引物(F:5'AACTAGGGGTATAGTT GAGAG3';R:5'CAGAAGCTAAAGGAG GATAA3')特異性較高。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取eDNA顯示,eDNA濃度在10.43-19.91ng/μL,A260/A280在1.80-1.97范圍之內(nèi),表明提取獲得eDNA質(zhì)量較高,可用于下一步實(shí)驗(yàn)分析。

        2.2 克氏原螯蝦DNA濃度與Ct標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        將重組質(zhì)粒DNA稀釋成不同濃度梯度(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9),以稀釋后的DNA為模板,qRT-PCR擴(kuò)增,根據(jù)Ct值的變化生成克氏原螯蝦COI的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)?;貧w方程為Y=-3.3507X+41.842,R2=0.998>0.99,說(shuō)明本研究在稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠正確反映出克氏原螯蝦COI基因的擴(kuò)增。

        圖1 克氏原螯蝦COⅠ基因的qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.3 儲(chǔ)存方式與時(shí)間對(duì)水樣eDNA富集的影響

        圖2為不同保存方式與時(shí)間對(duì)環(huán)境中eDNA提取濃度的影響,從圖中可以看出,4℃保存比室溫保存水樣提取eDNA濃度高,說(shuō)明冷藏保存水樣可以減少環(huán)境中eDNA的降解。此外,不同保存時(shí)間對(duì)eDNA富集的影響不同,4℃和RT保存方式在8h內(nèi),提取的eDNA濃度無(wú)顯著性差異(P>0.05),超過(guò)8h后,提取eDNA濃度顯著降低(P<0.05)。

        圖2 不同保存方式與時(shí)間對(duì)環(huán)境中eDNA提取濃度的影響

        2.4 不同孔徑濾膜及水樣體積對(duì)eDNA提取的影響

        通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在濾膜沒有出現(xiàn)堵塞的情況下,同一材質(zhì)、不同孔徑的濾膜過(guò)濾相同體積的水樣,濾膜孔徑越大,提取的eDNA濃度越小(圖3)。濾膜未出現(xiàn)堵塞情況下,同一材質(zhì),同一孔徑濾膜過(guò)濾不同體積的水樣,過(guò)濾的水樣體積越大,提取的水樣eDNA濃度越大(圖4)。表明使用0.45μm的硝酸纖維膜過(guò)濾2000mL的水樣提取的eDNA濃度最高。

        圖3 不同濾膜孔徑及過(guò)濾水量富集水樣中eDNA的濃度

        圖4 不同保存方式及過(guò)濾體積對(duì)水樣eDNA富集的影響

        2.5 eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)蝦籠監(jiān)測(cè)的比較

        將實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)克氏原螯蝦的水樣稀釋成不同濃度梯度(1只/L,1只/10L,1只/100L,1只/1000L,1只/10000L和1只/100000L),以稀釋后的DNA為模板,qRT-PCR擴(kuò)增,根據(jù)Ct值的變化生成克氏原螯蝦種群密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=2.371X+29.9(R2=0.995)。qRT-PCR檢測(cè)不同樣點(diǎn)環(huán)境eDNA中COI基因擴(kuò)增Ct值,依據(jù)Ct擬合不同樣點(diǎn)克氏原螯蝦種群密度。與傳統(tǒng)蝦籠法統(tǒng)計(jì)的不同樣點(diǎn)克氏原螯蝦數(shù)量比較,發(fā)現(xiàn)eDNA技術(shù)比傳統(tǒng)蝦籠法統(tǒng)計(jì)克氏原螯蝦種群密度更靈敏(見表1),且靠近人類活動(dòng)活躍的水域克氏原螯蝦種群密度較高(見圖5),表明人類活動(dòng)可能是引起克氏原螯蝦成功入侵草海的主要原因。

        表1 各監(jiān)測(cè)點(diǎn)克氏原螯蝦eDNA和地籠法檢測(cè)結(jié)果

        圖5 草??耸显r采樣點(diǎn)及分布趨勢(shì)圖注:S1-S15代表不同的采樣點(diǎn)

        3 討論

        與傳統(tǒng)的蝦籠捕撈調(diào)查法相比,eDNA技術(shù)更加靈敏、省時(shí)省力且經(jīng)濟(jì)高效,尤其是對(duì)于物種種群密度較低的情況下,此方法能更快更準(zhǔn)確地反應(yīng)被調(diào)查物種的分布與資源量狀況。然而,對(duì)于不同特點(diǎn)的水樣及不同生活習(xí)性的物種,eDNA富集的條件和提取方法均會(huì)有差異,因此,對(duì)于特定的生境和物種特征,探究最適eDNA富集條件是進(jìn)一步檢測(cè)目的物種分布與生物量狀況的前提。

        3.1 水樣的保存與eDNA的富集

        水樣eDNA分析過(guò)程包括水樣的采集和保存、水樣DNA提取和DNA分析。對(duì)于不同的取樣環(huán)境、不同生活習(xí)性的目標(biāo)物種及不同的研究目的,樣品采集和保存的方法也不盡相同[5-9]。已有研究表明,大多數(shù)研究的水樣采集量在15mL-10L,其中海洋、江河、溪流、池塘和湖泊的采樣量一般為1-2L[10]。雖然有研究表明室溫保存和冷凍保存水樣1-2d后過(guò)濾水樣對(duì)eDNA檢測(cè)結(jié)果沒有明顯影響,然而,針對(duì)eDNA技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)江江豚發(fā)現(xiàn),冷藏條件下保存的水樣中能提取到更高濃度的eDNA,樣品保存48h后,eDNA降解速率會(huì)顯著增加,檢測(cè)eDNA的濃度會(huì)急劇下降,最終在312h降低到檢測(cè)閾值以下[4]。與長(zhǎng)江江豚相同,本研究中冷藏4℃保存的水樣后續(xù)提取的eDNA濃度顯著高于室溫保存的水樣,但在儲(chǔ)存8h后,提取eDNA的濃度會(huì)顯著下降,這可能是由于物種差異造成。因此針對(duì)草海克氏原螯蝦eDNA保存最佳方式是4℃冷藏保存8h。目前使用富集eDNA的濾膜主要有玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、尼龍膜和聚碳酸酯膜[9]。多數(shù)研究表明硝酸纖維膜的富集效果較好,因此本研究采用不同孔徑的硝酸纖維膜富集eDNA。對(duì)于渾濁的長(zhǎng)江水樣,1μm孔徑的濾膜會(huì)迅速堵塞,1L水樣需要過(guò)濾40-60min。吳呁晟等在利用eDNA技術(shù)調(diào)查長(zhǎng)江江豚中發(fā)現(xiàn),增大濾膜孔徑至5μm,同時(shí)提高抽濾水量至1L,能快速完成水樣過(guò)濾,且成功檢測(cè)到長(zhǎng)江江豚eDNA[4]。eDNA物質(zhì)顆粒的大小會(huì)受環(huán)境因素影響,如高溫會(huì)加速較小直徑顆粒的分解及其中eDNA的降解,水流作用會(huì)導(dǎo)致顆粒迅速下沉,分解為小于100μm的顆粒。通過(guò)定量分析不同孔徑硝酸纖維膜富集草??耸显reDNA發(fā)現(xiàn),0.45μm孔徑的纖維膜富集eDNA濃度最高。此外,與其他研究結(jié)果相一致[11-15],本研究中eDNA富集濃度會(huì)隨著過(guò)濾水體體積的增加而不斷增加。綜上,適合草??耸显reDNA富集最適條件是:4℃冷藏保存水樣8h,0.45μm硝酸纖維膜過(guò)濾2000mL水體提取eDNA濃度最高。

        3.2 傳統(tǒng)蝦籠法與eDNA技術(shù)對(duì)比

        雖然蝦籠法在每個(gè)采樣點(diǎn)都成功捕獲了不同數(shù)量的克氏原螯蝦,但針對(duì)入侵物種在入侵初期種群密度較低的情況下,eDNA技術(shù)更靈敏、快速和低耗[2,16-18]。且由于不同動(dòng)物運(yùn)動(dòng)范圍不同,蝦籠法統(tǒng)計(jì)獲得的動(dòng)物分布情況不能精準(zhǔn)地反映該采樣點(diǎn)單位體積水域目的動(dòng)物的分布密度。但本研究中通過(guò)eDNA技術(shù)檢測(cè)草??耸显r分布密度的15個(gè)檢測(cè)點(diǎn)中,有兩個(gè)檢測(cè)點(diǎn)沒能成功富集及提取水樣中eDNA,使得該兩個(gè)采樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)缺失。因此,為提高被檢測(cè)物種的檢測(cè)率,采樣時(shí)要擴(kuò)大采樣面積、增加采樣點(diǎn)數(shù)量和單次采樣的重復(fù)次數(shù)。其中,單次采樣的重復(fù)次數(shù)對(duì)被檢測(cè)物種的檢出率影響較大,重復(fù)數(shù)從3次減少至2次或1次時(shí),物種的檢出率顯著降低。Moyer等對(duì)池塘表層水、中層水和底層水提取的DNA分析發(fā)現(xiàn),表層水和低層水提取的DNA的質(zhì)量較好。貴州草海屬于高原濕地,生態(tài)環(huán)境不同于池塘,且克氏原螯蝦多生活在水域底層,且生性好挖掘,因此,在研究中應(yīng)分水層或分河段取樣加以混合等措施,進(jìn)一步細(xì)化eDNA技術(shù)調(diào)查克氏原螯蝦分布的最佳條件。

        4 結(jié)論

        針對(duì)近年來(lái)克氏原螯蝦入侵草海,對(duì)草海生態(tài)系統(tǒng)中的水生植物、兩棲動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的生存造成了嚴(yán)重威脅,嚴(yán)重影響草海的生物多樣性,本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析比較不同水樣保存方式(4℃和室溫)、保存不同時(shí)間(4h,8h,32h,56h,80h)、不同過(guò)濾體積(150mL,300mL,500mL,1000mL,2000mL)和不同孔徑硝酸纖維膜對(duì)提取eDNA的影響。此外,實(shí)驗(yàn)室提取獲得克氏原螯蝦肌肉組織不同濃度DNA,通過(guò)qRT-PCR擴(kuò)增克氏原螯蝦中COI基因,繪制克氏原螯蝦COI基因qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線;另一方面通過(guò)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)克氏原螯蝦,繪制環(huán)境DNA濃度與克氏原螯蝦種群密度標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)草海不同采樣點(diǎn)環(huán)境DNA中克氏原螯蝦COI濃度,將環(huán)境DNA檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合,推算克氏原螯蝦的分布特點(diǎn)和分布生物量。研究表明,4℃保存8h內(nèi),0.45μm孔徑硝酸纖維膜過(guò)濾2000mL水體提取eDNA效果最好,且過(guò)濾水體體積越大,富集eDNA濃度越高。與傳統(tǒng)地籠法相比,eDNA檢測(cè)法更靈敏,且在靠近城市人類活動(dòng)較活躍的采樣點(diǎn)克氏原螯蝦分布密度越高,表明人類活動(dòng)可能是導(dǎo)致克氏原螯蝦成功入侵草海的主要原因。本研究為進(jìn)一步分析克氏原螯蝦的引入或擴(kuò)散初期的監(jiān)測(cè)、預(yù)警和應(yīng)急處理提供有效依據(jù)。

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