趙 軍，李金海，周建海，吳書維，郭正威

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700）

黃酮類化合物在自然界中分布較為廣泛，主要存在于一些可食用的果蔬以及藥用植物中，多為色原烷或色原酮的衍生物。其多數(shù)具有C6_C3_C6基本碳架，并含有兩個苯環(huán)，通過中央碳原子連接成一組生物化合物[1-4]。根據(jù)中央碳原子的氧化與成環(huán)程度可將黃酮類化合物分為黃酮類、黃酮醇類、雙氫黃酮類、雙氫黃酮醇類等多種類型。當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物種類已高達(dá)8000余種，在大部分植物的葉片與果實中均以游離形式存在，大部分黃酮類化合物與糖結(jié)合成葡類一碳糖配基，并游離于植物之中3-4。黃酮類化合物具有多種生物活性，如抗氧化、抗自由基作用，對于抗癌、治療心腦血管疾病有一定療效。20世紀(jì)60年代，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)具有抗油脂過氧化的活性。20世紀(jì)80年代，黃酮類化合物逐漸被證實具有治療老年病的功能。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，黃酮類化合物在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域的應(yīng)用前景看好。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，為有效獲取黃酮類化合物，并對其進行更為高效的利用，開展了天然產(chǎn)物黃酮類抗氧化活性成分分析及其提取技術(shù)研究。

1 實驗部分

1.1 天然產(chǎn)物黃酮類成分抗氧化活性分析方法

通常，主要通過檢測黃酮類成分對自由基的清除能力來評價其抗氧化活性。分析過程中，采用DPPH檢測方法[5-6]對黃酮的活性進行分析，依據(jù)DPPH還原產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，將DHHP溶液與黃酮類成分充分融合后，黃酮類成分中的自由基會出現(xiàn)相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光信號，監(jiān)測發(fā)光強度以評價黃酮類成分抗氧化活性,涉及的主要化學(xué)反應(yīng)為：

抗氧化活性測定過程為，根據(jù)下圖連接測定設(shè)備，將設(shè)備中的管路清洗干凈，并加入相應(yīng)的測定試劑。

圖1 黃酮類成分抗氧化活性測定設(shè)備流路圖

在上圖中,c為樣品流入口，d為Cu+-H2O2溶液流入口，e為H2O流入口，f為H2O2流入口。使Cu+-H2O2化學(xué)試劑的發(fā)光強度為空白狀態(tài)，而后測定各待測黃酮類成分的發(fā)光強度，并根據(jù)下述公式計算黃酮類成分的抑制率。具體計算公式如下所示：

上式中，A表示黃酮類成分的抑制率[7-8]，B0表示Cu+-H2O2化學(xué)試劑的發(fā)光強度,B表示各待測黃酮類成分的發(fā)光強度，通過此公式計算得出黃酮類成分的抗氧化活性，完成黃酮類成分抗氧化活性分析過程。

1.2 天然產(chǎn)物黃酮類成分提取工藝設(shè)計

1.2.1 提取試劑及設(shè)備

根據(jù)黃酮類化合物的特點，在此次設(shè)計中選取適用于此化合物的實驗試劑作為黃酮類化合物提取過程中的試劑，具體實驗試劑如表1所示。

表1 實驗試劑選取結(jié)果

(提取過程中，所涉及的主要實驗設(shè)備如表2所示)

表2 實驗設(shè)備選型結(jié)果

1.2.2 提取過程設(shè)定

提取過程中，主要采用大孔樹脂法進行分離提取，通過黃酮類成分與樹脂表面基團作用[9-10]，使黃酮類成分與其他物質(zhì)進行分離。因此，需要對大孔樹脂進行選定，在此次設(shè)計中，為保證提取效果，設(shè)定大孔樹脂的類型共為5類，具體如表3所示。

表3 大孔樹脂規(guī)格及性能設(shè)定

使用上述設(shè)定的大孔樹脂，完成黃酮成分的提取過程，具體提取過程設(shè)定為：將待提取樣本去除雜質(zhì)后，在60℃以上的環(huán)境中烘干24 h，然后采用粉碎機將待測樣本粉碎，通過國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)篩[11]，得到待測樣本粉末。將獲取到的粉末，加入超聲微波協(xié)同萃取儀器中，取10-20倍的實驗試劑，進行24 h的抽取，將得到的粉末放置到干燥箱中進行烘干，備用。將選定的實驗試劑靜止于分液漏斗中，在室溫環(huán)境中對其進行充分的混合并靜置15 min，使其完全分層，而后使用玻璃容器將試劑分開，在使用其進行提取前進行15 min超聲脫氣。

稱取處理后的待測樣本粉末放入三角燒杯中，將其與實驗試劑融合。而后按照下列條件使用超聲波進行處理，并對提取液趁熱進行處理，少量抽取提取后的殘渣，合并濾液，將其放置到50ml容量瓶中等待抽取。具體提取工藝流程如圖2所示。

圖2 提取工藝流程

在上述流程中，為有效控制大孔樹脂的吸附量[12-13]，設(shè)定下述計算過程。在吸附的過程中，通過公式控制其吸附總量，具體公式為：

上式中，Pi表示靜態(tài)吸附總量，di表示待測溶液的初始濃度，d0表示待測溶液吸附后濃度，h表示待測溶液體積。同理可通過計算得到靜態(tài)吸附容量[12-13]的計算公式，具體如下：

在上式中，Ci表示靜態(tài)吸附容量，w表示大孔樹脂在干燥時的凈重。通過上述兩部分公式可得出靜態(tài)解吸率與動態(tài)解析率計算公式為

在上式中，S表示靜態(tài)解吸率與動態(tài)解析率，h表示洗脫試劑總體積。通過此公式，控制大孔樹脂部分的處理工作，確保此部分工作不會對提取精度造成影響。

通過上述設(shè)定流程，完成天然產(chǎn)物中黃酮類成分的提取工作，為保證提取結(jié)果的精度，對在天然產(chǎn)物中提取到的黃酮類成分總量展開計算，具體公式為：

在上式中，k1表示天然產(chǎn)物中的黃酮類成分總量，j表示樣本液體濃度，u表示樣本液體積，k表示待測天然產(chǎn)物質(zhì)量。依據(jù)此公式計算黃酮類成分的提取率[14-15]，具體公式為：

上式中，n表示提取過程中的稀釋倍數(shù)，k2表示天然產(chǎn)物提取液中的總黃酮含量，k1表示天然產(chǎn)物中的黃酮類成分總量，l表示黃酮類成分提取率。使用上述計算部分，對天然產(chǎn)物黃酮成分提取過程進行控制，保障成分提取結(jié)果的精度。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類成分抗氧化活性分析結(jié)果

黃酮類成分抗氧化活性分析結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，草本植物中含有黃酮成分總量高于木本植物。通過系統(tǒng)分析可知，天然產(chǎn)物的黃酮含量總量與黃酮成分的抗氧化活性具有直接的效量關(guān)系。天然產(chǎn)物中黃酮含量直接影響著此產(chǎn)物的抗氧化能力，并對抗氧化強度起到了決定性作用。部分天然產(chǎn)物中的化合物具有較高的黃酮類成分，這是否預(yù)示著其具有較高的抗氧化能力，還有待深入研究考證。

圖3 天然物質(zhì)抗氧化活性測定結(jié)果

同時，天然產(chǎn)物中的黃酮類成分種類較多，但不是所用的黃酮類成分都具有抗氧化性，其抗氧化性與黃酮類成分的元素組合結(jié)構(gòu)有關(guān)。黃酮成分的元素組合結(jié)構(gòu)是抗氧化活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其具有供氫氧化的作用。在后續(xù)研究中，將對其結(jié)構(gòu)進行深入研究。

2.2 提取工藝優(yōu)化結(jié)果

為驗證所設(shè)計的天然產(chǎn)物黃酮類成分提取技術(shù)的使用效果，設(shè)定技術(shù)應(yīng)用測試分析環(huán)節(jié)，對其展開全面的研究。提取過程中，選用多種原料，使用文中設(shè)計技術(shù)與其他提取技術(shù)對設(shè)定原料進行提取，以比較其他技術(shù)與文中設(shè)計技術(shù)的提取效率。為保證測試結(jié)果對比的有效性，在測試進行前，對待測材料中含有的黃酮類成分含量進行紫外分光光度計測定，為對比結(jié)果提供支撐。

在提取過程中，使用ASE-100加速溶劑萃取過程采用高壓形式完成提取。研究表明，該試劑中的顆粒數(shù)目對其提取影響不大，均采用50目原料進行提取。根據(jù)對以往提取方法的研究以及文獻查證結(jié)果，天然產(chǎn)物中的黃酮類成分提取時，其處理溫度不宜超過90℃；同時，由于黃酮類成分多存在于植物中，其原料溶液配比設(shè)定為1:15，該條件下，黃酮類成分提取率較高。在測試過程中將測試時長控制在15分鐘內(nèi)，提取過程設(shè)定為3次，共進行一輪測試。在測試過程中為保證多種提取技術(shù)可在同一實驗室環(huán)境中完成提取過程，設(shè)定測試儀器如表4所示。

表4 測試儀器選型結(jié)果

基于上述條件，設(shè)定測試原料代號為Y1、Y2、Y3，進行提取研究，對于提取后的黃酮成分精度，采用SPSS 16.0處理單因素實驗數(shù)據(jù)并分析，采用Design-Expert對響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝數(shù)據(jù)進行分析處理。

提取結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取效率測試結(jié)果

結(jié)果顯示，文中設(shè)計提取工藝對黃酮類成分提取效率更高。其中，各因素的交互作用對肉桂黃酮提取液的吸光度Y的三維空間曲面及二維等高線圖，如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對黃酮提取液吸光度影響的響應(yīng)面圖

由上圖可以看出，等高線沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向變化較沿液料比軸向變化更密集，且沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向的三維曲面更陡，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對吸光度Y的影響更顯著，等高線沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向變化較沿萃取溫度軸向變化稍密集，且沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向的三維曲面較陡，所以乙醇體積分?jǐn)?shù)比萃取溫度對吸光度Y的影響稍顯著些。

2.3 自由基的清除結(jié)果

通常，DPPH自由基的清除效果以清除率評價，清除率計算公式為：

式中，A0表示與自由基反應(yīng)前的各成分峰面積，A1表示與自由基反應(yīng)后剩余的各成分峰面積。黃酮中各成分對DPPH自由基的清除率如表5所示。

表5 黃酮中各成分對DPPH自由基的清除率

如圖6所示，得到天然產(chǎn)物黃酮中各成分對DPPH自由基的清除效果。A為黃酮與DPPH自由基反應(yīng)前的HPLC圖，B為黃酮與DPPH自由基反應(yīng)后的HPLC圖。

圖6 天然產(chǎn)物黃酮清除DPPH自由基的HPLC圖

由圖6以及表5可以看出，沒食子酸和原花青素B2為清除DPPH自由基活性最強的兩種化合物。其主要原因在于沒食子酸是苯甲酸型的酚酸化合物，同時含有三個酚羥基，處于羧基對位的酚羥基對抗氧化作用非常小，而在羧基間位上含有兩個羥基，極大地增強了該物質(zhì)抗氧化作用。表兒茶素是黃烷醇類化合物，從其結(jié)構(gòu)上來看，C環(huán)2、3位上不存在雙鍵且4位上也不存在羰基鍵，這可能是造成表兒茶素這種抗氧化物質(zhì)清除DPPH自由基活性低的主要原因。槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷和槲皮素-3-O-木糖苷均為槲皮素3位羥基上的氫被取代，會降低其活性。因此，這兩種物質(zhì)的DPPH自由基清除活性均不高。

3 結(jié)論

研究過程中，以天然產(chǎn)物作為研究對象，優(yōu)化提出了更適用于黃酮提取的最佳工藝。研究結(jié)果將對黃酮的活性成分提取，以及天然產(chǎn)物中的黃酮成分結(jié)構(gòu)和含量分析提供有益的參考和支撐。后續(xù)研究工作中，將深入開展相應(yīng)的活性篩選研究工作，以找出抗氧化活性更高的黃酮化合物，并探索其結(jié)構(gòu)與活性間的構(gòu)效特征。