尹書會(huì) 曹清禹 張倩 王默力

抗血小板聚集治療能降低缺血性卒中的復(fù)發(fā)率，其作為二級(jí)預(yù)防的策略已被指南明確推薦[1]。臨床中，有部分患者經(jīng)正規(guī)抗血小板聚集藥物治療后仍發(fā)生了復(fù)發(fā)缺血性腦血管事件。氯吡格雷是臨床常用的抗血小板聚集藥物，可有選擇、不可逆地阻斷腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)與血小板上的受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集。該藥需經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450 2C19(cytochrome P450 2C19，CYP2C19)氧化后成為有活性的代謝產(chǎn)物，因此，CYP2C19的遺傳變異可能降低氯吡格雷的轉(zhuǎn)化效率。既往研究表明，CYP2C19的遺傳變異與氯吡格雷抵抗有關(guān)[2-4]，但也有研究認(rèn)為二者的關(guān)系不肯定[5-7]。本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)251例缺血性卒中患者CYP2C19不同代謝型基因的血小板抑制水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[8]，故本研究對(duì)CYP2C19快代謝基因型缺血性卒中患者的臨床資料進(jìn)行分析，擬探討其與氯吡格雷抵抗的相關(guān)臨床因素。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

連續(xù)納入2014年5月至2019年2月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的204例缺血性卒中患者進(jìn)行回顧性分析，缺血性卒中的診斷符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》標(biāo)準(zhǔn)[9]，且均為需要服用氯吡格雷的CYP2C19快代謝型基因(CYP2C19*1/*1)。204 例患者中，男153 例，女51 例；年齡31～86 歲，平均(62±11)歲。本研究方案已獲得首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理號(hào)：臨研審(2017)011號(hào)]，患者或其家屬簽署了診療知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)漢族；(2)年齡≥18 歲；(3)距最近一次非心源性腦梗死≤1 個(gè)月；(4)卒中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估量表(essen stroke risk score，ESRS)評(píng)分≥3分[10]；(5)CYP2C19基因分型為快代謝型(CYP2C19*1/*1)[11]；(6)影像學(xué)及基線資料完整；(7)生命體征平穩(wěn)，依從性好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)對(duì)氯吡格雷過敏；(2)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和(或)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶大于正常值上限的2倍；(3)重度腎功能不全(內(nèi)生肌酐清除率<30 ml/min)；(4)血小板計(jì)數(shù)<100×109/L、白細(xì)胞計(jì)數(shù)<4.0×109/L；(5)入院前1個(gè)月內(nèi)活動(dòng)性出血(顱內(nèi)出血、消化性潰瘍等)；(6)存在可能造成心源性栓塞的疾病(心房顫動(dòng)、心臟瓣膜病、入院前4周內(nèi)心肌梗死、心室壁瘤形成等)；(7)患有其他系統(tǒng)疾病不能配合治療。

1.3 資料收集及藥物治療策略

收集并記錄入組患者的基線資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，基線資料包括年齡、性別、既往史(高血壓病、高脂血癥、糖尿病、冠心病)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)包括血常規(guī)、空腹血糖、糖化血紅蛋白、肝腎功能、血脂、尿酸、同型半胱氨酸等。

既往史的診斷依據(jù)為入院前已診斷或正在使用相關(guān)藥物，或入院時(shí)符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分別為《中國(guó)高血壓防治指南(2018 年修訂版)》[12]、《中國(guó)成人血脂異常防治指南(2016 年修訂版)》[13]、《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)》[14]、《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》[15]。

根據(jù)《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]，于確認(rèn)后給予患者口服氯吡格雷(杭州賽諾菲公司，批號(hào)：5A797)75 mg/d，除阿司匹林腸溶片外，禁止使用其他抗血小板聚集藥物，并進(jìn)行調(diào)脂、降壓、降糖等治療。連續(xù)服用氯吡格雷7 d，第8天晨起空腹抽取靜脈血，2 h內(nèi)完成血栓彈力圖血小板圖的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均為入院次日晨起空腹靜脈血檢測(cè)所得。

1.4 基因測(cè)序方法

入院次日晨起抽取空腹靜脈血，使用CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒(上海百傲科技有限公司生產(chǎn))，從外周血中提取基因組DNA。用CYP2C19基因特異引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物與試劑盒(DNA微陣列芯片)雜交。使用BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀分析圖像并判斷基因型。檢測(cè)的CYP2C19基因位點(diǎn)有*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3，利用CYP2C19基因檢測(cè)試劑，經(jīng)基因測(cè)序篩選出CYP2C19基因快代謝型(野生純合子CYP2C19 *1/*1)。

1.5 血小板抑制率檢測(cè)及分組標(biāo)準(zhǔn)

使用血栓彈力圖分析儀(型號(hào)：TEG5000，Haemoscope公司，美國(guó))測(cè)定的數(shù)據(jù)計(jì)算血小板抑制率。由2 μmol/L ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率<30%為氯吡格雷抵抗，血小板抑制率≥30%為氯吡格雷非抵抗[16]，分別分為氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷非抵抗組。

由計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算血小板抑制率，其計(jì)算方法[17]：血小板抑制率(%)=[1-(MAADP-MAfibrin)/(MAthrombin-MAfibrin)]×100%，其中MA為最大幅度，表示形成血凝塊的最大強(qiáng)度；MAADP為ADP誘導(dǎo)的血凝塊強(qiáng)度，包括纖維蛋白和服用氯吡格雷未被抑制的血小板；MAfibrin為纖維蛋白的血凝塊強(qiáng)度；MAthrombin為凝血酶誘導(dǎo)的血凝塊強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基線資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較

204 例CYP2C19快代謝型(CYP2C19*1*1)缺血性卒中患者中，氯吡格雷抵抗組65 例(31.9%)，氯吡格雷非抵抗組139例(68.1%)。氯吡格雷抵抗組女性、高血壓病史比例及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于氯吡格雷非抵抗組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。兩組患者年齡、高脂血癥、糖尿病、冠心病、血小板計(jì)數(shù)、糖化血紅蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、尿酸、同型半胱氨酸的組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組CYP2C19快代謝型缺血性卒中患者基線資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較

2.2 氯吡格雷抵抗的影響因素分析

以氯吡格雷抵抗為因變量，將單因素分析中P<0.05的項(xiàng)目作為自變量納入二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，女性、既往高血壓病史、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)均為發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見表2。

表2 CYP2C19快代謝型缺血性卒中患者氯吡格雷抵抗的多因素Logistic回歸分析

3 討論

氯吡格雷是臨床常用的一種抗血小板聚集藥物，其抗血小板聚集效果存在差異。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)劑量氯吡格雷治療后，ADP誘導(dǎo)的血小板功能未達(dá)到有效抑制，稱為氯吡格雷抵抗[18]，也有研究將其稱為血小板高反應(yīng)性，其發(fā)生率報(bào)道不一[19-20]。Jover等[19]對(duì)缺血性腦血管病患者服用氯吡格雷7 d后分別使用血小板功能分析儀、血管擴(kuò)張刺激磷蛋白磷酸化法、光學(xué)比濁法、VerifyNow P2Y12測(cè)定法檢測(cè)血小板功能，結(jié)果顯示，治療后血小板高反應(yīng)性占比分別為7/18、8/18、9/18、10/18，且治療后90 d與7 d的血小板高反應(yīng)性占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Fu等[20]對(duì)急性缺血性卒中患者服用氯吡格雷7 d后的血小板功能應(yīng)用光學(xué)比濁法進(jìn)行檢測(cè)，顯示仍有48.1%(63/131)的患者呈現(xiàn)血小板高反應(yīng)性。Kinsella等[21]對(duì)服用氯吡格雷的短暫性腦缺血發(fā)作或缺血性卒中患者應(yīng)用血小板功能分析儀檢測(cè)血小板功能，研究發(fā)現(xiàn)治療后血小板高反應(yīng)性患者占比達(dá)92.0%(23/25)。上述研究對(duì)治療后血小板高反應(yīng)性占比存在差異的原因可能與檢驗(yàn)方法和評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，光學(xué)比濁法是檢驗(yàn)血小板功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法的影響因素較多，穩(wěn)定性欠佳，可重復(fù)性差[22]。血栓彈力圖檢測(cè)血小板功能是近幾年常用的一種快速、可靠的檢測(cè)方法[23-25]。本研究利用血栓彈力圖檢測(cè)CYP2C19快代謝型(CYP2C19*1*1)缺血性卒中患者連續(xù)服用氯吡格雷7 d后的血小板功能，顯示氯吡格雷抵抗發(fā)生率為31.9%(65/204)。

除了藥物代謝酶的基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷療效的影響，氯吡格雷抑制血小板聚集的作用還可能受很多因素的影響，包括年齡[26-28]、性別[26-27，29]、吸煙[26]、體質(zhì)量指數(shù)[28，30]、高脂血癥[26，31]、高血壓病[32]、糖尿病[28,33-35]、糖耐量減低[36]、炎癥因子[27，34]、白細(xì)胞計(jì)數(shù)[27，31]、平均血小板體積[37]、糖化血紅蛋白[26]、同型半胱氨酸[31]、鈣通道阻滯劑[38-39]、質(zhì)子泵抑制劑[40]、苯二氮類藥物[30]等。既往研究多針對(duì)臨床因素及藥物代謝酶CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷抗血小板聚集藥物療效的影響，而本研究未對(duì)主要藥物代謝酶CYP2C19基因多態(tài)性的影響，僅納入了CYP2C19快代謝基因型(CYP2C19*1*1)的缺血性卒中患者，結(jié)果顯示，氯吡格雷抵抗組女性、高血壓病史比例及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于氯吡格雷非抵抗組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，女性、高血壓病、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平均是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。

有研究表明，女性可能無法從抗血栓治療中獲得與男性相同的益處[41]。性別不同導(dǎo)致抗血小板聚集藥物效果不同的機(jī)制尚未完全清楚，Patti 等[42]研究表明，抗血小板聚集藥物效果不同的可能機(jī)制：血小板功能存在性別差異，包括血小板黏附或聚集分子機(jī)制的位點(diǎn)、血小板計(jì)數(shù)、血小板表面受體及結(jié)合的纖維蛋白原數(shù)量等均有差異，并且血管因素、凝血機(jī)制，甚至雌激素水平、體型等因素均可能參與其中。因此，女性缺血性卒中患者需要服用氯吡格雷時(shí)要考慮到可能出現(xiàn)的氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)監(jiān)測(cè)血小板抑制率。

目前，高血壓病史影響氯吡格雷抗血小板聚集藥物療效的機(jī)制尚未清楚。Nadar和Lip[43]認(rèn)為，高血壓病患者血小板功能可因多種原因處于活化狀態(tài)，且可有更強(qiáng)的聚集性和黏附性。既往研究發(fā)現(xiàn)，鈣通道阻滯劑的使用可能與氯吡格雷抵抗有關(guān)，并且鈣通道阻滯劑在伴高血壓病的缺血性卒中患者中使用率較高，其與氯吡格雷的代謝均需經(jīng)肝臟藥物代謝酶CYP3A4的作用，后者為氯吡格雷代謝過程中比較重要的酶，因此，鈣通道阻滯劑可能影響氯吡格雷的轉(zhuǎn)化而使血小板抑制率降低[38-39]。Lee等[44]在氯吡格雷與其他藥物相互作用的研究中進(jìn)一步肯定了氯吡格雷抵抗與鈣通道阻滯劑的使用有關(guān)。因此，伴高血壓病的缺血性卒中患者使用氯吡格雷時(shí)最好監(jiān)測(cè)血小板抑制率，尤其同時(shí)使用鈣通道阻滯劑時(shí)，更需要考慮可能出現(xiàn)的氯吡格雷抵抗。本研究不足之處在于未統(tǒng)計(jì)高血壓病患者降壓藥的使用情況，因此，服用氯吡格雷的缺血性卒中患者選用鈣通道阻滯劑降壓是否合適，尚需今后的研究進(jìn)一步探討。

目前，白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平參與氯吡格雷抵抗的機(jī)制尚未明確。謝文劍等[45]在冠心病存在氯吡格雷抵抗患者的外周血白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)3個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)，與氯吡格雷非抵抗組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究提示3個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA可作為潛在生物標(biāo)志物以評(píng)估氯吡格雷反應(yīng)性。動(dòng)脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮的非特異性炎性反應(yīng)有關(guān)，而白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞在這種非特異性炎性反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[46]。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，中性粒細(xì)胞不僅數(shù)量增多，功能增強(qiáng)，并且中性粒細(xì)胞可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)組織因子表達(dá)，并釋放中性粒細(xì)胞外誘捕陷阱，中性粒細(xì)胞外誘捕陷阱內(nèi)的組織因子誘導(dǎo)凝血酶生成和血小板活化、黏附和聚集，從而促進(jìn)血栓形成[47]。因此，對(duì)于需要服用氯吡格雷的缺血性卒中患者，若其白細(xì)胞處于正常偏高水平，應(yīng)警惕氯吡格雷抵抗。

本研究仍有很多不足之處：本研究為單中心回顧性研究，樣本的選擇上可能存在偏倚；未對(duì)CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷代謝的影響進(jìn)行研究，故未能全面考慮氯吡格雷從腸道吸收、代謝及作用于血小板受體等過程中基因多態(tài)性及合并用藥的影響；樣本量較少，尤其是女性比例較低，可能使結(jié)果產(chǎn)生偏倚。另外，本研究?jī)H在服用氯吡格雷7 d后檢測(cè)1次血小板抑制率，尚不能反映服用氯吡格雷過程中血小板抑制率的總體水平。盡管血小板抑制率與實(shí)際臨床事件之間的關(guān)系、導(dǎo)致氯吡格雷抵抗的因素均未明確，基于精準(zhǔn)治療的目的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)調(diào)整治療有一定的臨床指導(dǎo)意義。