靳 濤，武 倩，董 雨，崔曉東

腦缺血或缺血性腦卒中是常見(jiàn)的急性腦血管疾病，嚴(yán)重威脅人類身體健康，缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷是其發(fā)病的重要因素，開(kāi)發(fā)新的藥物用于神經(jīng)保護(hù)對(duì)其治療具有重要意義[1-2]。鹽酸戊乙奎醚又名長(zhǎng)托寧，是一種選擇性抗膽堿藥，作為逆轉(zhuǎn)劑和麻醉藥被廣泛應(yīng)用于臨床。研究顯示，長(zhǎng)托寧對(duì)心臟、肺、大腦等多器官具有保護(hù)作用[3]。研究顯示，長(zhǎng)托寧對(duì)大鼠內(nèi)毒素性腦損傷后血腦屏障通透性具有保護(hù)作用[4]。長(zhǎng)托寧預(yù)處理可通過(guò)抑制海馬組織細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的(ERK)1/2激活而減輕小鼠反復(fù)缺血-再灌注腦損傷并改善其學(xué)習(xí)記憶能力[5]。長(zhǎng)托寧可能通過(guò)抑制肺組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕新生大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷[6]。然而長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚不明確。研究表明，微小RNA(miRNA)參與缺血性腦卒中的一系列病理生理過(guò)程[7]。缺血小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2A細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)降低，miR-183-5p過(guò)表達(dá)，通過(guò)負(fù)調(diào)控張力蛋白同源物(PTEN)減輕腦缺血損傷[8]。上調(diào)miR-183-5p表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕腦出血后的早期損傷[9]。因此，本研究探討長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及其與miR-183-5p的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞株(貨號(hào)：XB-3033，上海奧陸生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：YB150110B，上海鈺博生物科技有限公司)；長(zhǎng)托寧(貨號(hào)：100931，上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號(hào)：1531704953)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號(hào)：1533806644)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號(hào)：1534619774)均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號(hào)：A025，美國(guó)GeneCopoeia公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)：AR0102)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：AR0146)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；TaqMan MicroRNA定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(貨號(hào)：MTTXXXXX-ZCO，北京百奧萊博科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞處理與分組 PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、95%O2、5%CO2條件下培養(yǎng)作為對(duì)照組；將PC12細(xì)胞置于37 ℃、1%O2、94%N2、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h作為缺氧組；分別用0.01 μmol/L、0.03 μmol/L、0.10 μmol/L的長(zhǎng)托寧處理PC12細(xì)胞，再進(jìn)行缺氧處理，作為缺氧+長(zhǎng)托寧低、中、高劑量組；將miR-NC、miR-183-5p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理，作為缺氧+miR-NC組、缺氧+miR-183-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-183-5p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后，經(jīng)0.1 μmol/L的長(zhǎng)托寧處理，再進(jìn)行缺氧處理，作為缺氧+長(zhǎng)托寧+anti-miR-NC組、缺氧+長(zhǎng)托寧+anti-miR-183-5p組。

1.3 LDH漏出率、SOD活性、MDA含量的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出率以及細(xì)胞中SOD活性、MDA含量。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞，漂洗后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，混勻，避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取總蛋白、BCA測(cè)定蛋白濃度；蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜放入雜交袋中，倒入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，倒掉一抗，洗膜；加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，洗膜后用電化學(xué)發(fā)生(ECL)法顯色，暗室顯影、定影。Quantity-One分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)miR-183-5p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用TaqMan MicroRNA定量PCR試劑盒檢測(cè)miR-183-5p相對(duì)表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct公式進(jìn)行計(jì)算。miR-183-5p正向引物序列：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′，反向引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 結(jié) 果

2.1 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，缺氧組LDH漏出率增多、SOD活性降低、MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+長(zhǎng)托寧低、中、高劑量組LDH漏出率依次減少、SOD活性升高、MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧+長(zhǎng)托寧低、中、高劑量組LDH漏出率減少、SOD活性依次升高、MDA含量依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(±s)

2.2 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，缺氧組PC12細(xì)胞凋亡率升高、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低、Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+長(zhǎng)托寧低、缺氧+長(zhǎng)托寧低中、缺氧+長(zhǎng)托寧低高劑量組PC12細(xì)胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高、Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧+長(zhǎng)托寧低、中、高劑量組PC12細(xì)胞凋亡率依次升高、Bcl-2蛋白表達(dá)水平依次降低、Bax蛋白表達(dá)水平依次升高，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

表2 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響(±s)

2.3 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，缺氧組miR-183-5p表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+長(zhǎng)托寧低、缺氧+長(zhǎng)托寧中、缺氧+長(zhǎng)托寧高劑量組miR-183-5p表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧+長(zhǎng)托寧低、中、高劑量組miR-183-5p表達(dá)水平依次升高，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)的影響(±s)

2.4 miR-183-5p過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與缺氧+miR-NC組比較，缺氧+miR-183-5p組miR-183-5p表達(dá)水平升高，LDH漏出率減少，SOD活性升高，MDA含量降低，PC12細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2及表4。

圖2 miR-183-5p過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

表4 miR-183-5p過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響(±s)

2.5 抑制miR-183-5p表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與缺氧+長(zhǎng)托寧+anti-miR-NC組比較，缺氧+長(zhǎng)托寧+anti-miR-183-5p組miR-183-5p表達(dá)水平降低，LDH漏出率增加，SOD活性降低，MDA含量升高，PC12細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3及表5。

圖3 抑制miR-183-5p表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

表5 抑制miR-183-5p表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響(±s)

3 討 論

腦缺血后可發(fā)生氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等一系列病理過(guò)程，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[10-11]。PC12細(xì)胞是研究腦缺血損傷常用的細(xì)胞模型，本研究用缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模擬腦缺血細(xì)胞損傷。研究報(bào)道，長(zhǎng)托寧對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，其可抑制炎性因子的釋放和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[12]。長(zhǎng)托寧通過(guò)減輕細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[13]。長(zhǎng)托寧抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量長(zhǎng)托寧處理后，缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中LDH漏出率減少、SOD活性升高、MDA含量降低、PC12細(xì)胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高、Bax蛋白表達(dá)水平降低，表明長(zhǎng)托寧可抑制缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-183-5p可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[15]。miR-183-5p的過(guò)表達(dá)增加了應(yīng)激條件下神經(jīng)元的存活率，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥中保護(hù)神經(jīng)元免受細(xì)胞死亡[16]。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)水平降低，miR-183-5p過(guò)表達(dá)降低了缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中LDH漏出率、MDA含量，提高了SOD活性，降低了細(xì)胞凋亡率，表明miR-183-5p過(guò)表達(dá)具有抗缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。且本研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)托寧處理可提高缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)水平，而抑制miR-183-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了長(zhǎng)托寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。

綜上所述，長(zhǎng)托寧可能通過(guò)上調(diào)miR-183-5p表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。