張莉（北京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100176）

乙型病毒肝炎DNA（HBV-DNA）是一類嗜肝細(xì)胞DNA病毒，是感染人類最小的DNA病毒，具有易傳染、難治愈的特點(diǎn)，其本身對(duì)肝臟沒有致病性，只有在免疫細(xì)胞參與的情況下才會(huì)導(dǎo)致肝損傷[1]。我國(guó)是乙型病毒肝炎病毒感染人群最多的國(guó)家，乙型肝炎隨著病情進(jìn)展可逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌，我國(guó)每年約有30多萬人因肝硬化、肝癌等肝臟疾病死亡[2]。因此，準(zhǔn)確及時(shí)地診斷對(duì)乙肝患者的預(yù)后極其重要。臨床上HBV-DNA檢測(cè)主要依靠熒光定量PCR檢測(cè)法，是一種能夠準(zhǔn)確獲得病毒載量的定量檢測(cè)方法。檢測(cè)前常常需要提取樣本的DNA，目前主要有手工煮沸法（手工法）和全自動(dòng)磁珠法（全自動(dòng)法）兩種。本研究依據(jù)CNAS-CL02《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》、CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》等相關(guān)要求對(duì)HBV-DNA檢測(cè)的兩種不同核酸提取方法在使用相同的儀器和試劑的條件下進(jìn)行性能驗(yàn)證，分析其驗(yàn)證結(jié)果，從而選擇合適的優(yōu)化系統(tǒng)提高實(shí)驗(yàn)的正確性。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 HBV-DNA陽性標(biāo)本（北京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司）；正確度驗(yàn)證室間質(zhì)評(píng)樣本（國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心）；精密度驗(yàn)證高低值室內(nèi)質(zhì)控品（北京康斯坦徹公司）。

1.2儀器和試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用美國(guó)ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；核酸提取儀為中山達(dá)安基因公司Smart32全自動(dòng)核酸提取儀；檢測(cè)試劑采用中山達(dá)安基因公司生產(chǎn)的HBV-DNA檢測(cè)試劑盒；長(zhǎng)沙湘智高速冷凍離心機(jī)。

1.3方法

1.3.1批內(nèi)精密度 采用北京康斯坦徹公司生產(chǎn)的HBV-DNA質(zhì)控血清，樣本濃度為3.01×106Copies/ml作為高值血清樣本和2.54×103Copies/ml作為低值血清樣本，由同一操作人員在同一臺(tái)儀器進(jìn)行檢測(cè)。采用手工法和全自動(dòng)提取法在同一次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)高低值血清樣本各20次，記錄結(jié)果并計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)CV（%）。

1.3.2批間精密度 采用北京康斯坦徹公司生產(chǎn)的HBV-DNA高值血清，樣本濃度為2.11×106Copies/ml，每個(gè)工作日分別采用手工法和全自動(dòng)提取法在同一次實(shí)驗(yàn)中各檢測(cè)1次，檢測(cè)時(shí)間為2021年12月1日-2021年12月31日，共計(jì)23個(gè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，記錄結(jié)果，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)CV（%）。

1.3.3正確度 采用國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參考物質(zhì)，進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。選取5個(gè)濃度水平的參考物質(zhì)，每種重復(fù)檢測(cè)2次，連續(xù)檢測(cè)5天，取平均值并計(jì)算每個(gè)濃度水平的偏倚。

1.3.4線性范圍 取一份HBV-DNA混合血清定值為2.58×108Copies/ml的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，用陰性血清標(biāo)本按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000系列進(jìn)行稀釋至濃度為2.58×107Copies/ml、2.58×106Copies/ml、2.58×105Copies/ml、2.58×104Copies/ml、2.58×103Copies/ml、2.58×102Copies/ml。每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，以稀釋計(jì)算值作為理論值，對(duì)各濃度稀釋樣品的實(shí)測(cè)值與理論值進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程y=bx+a，相關(guān)系數(shù)為R2。R2越接近1，表明相關(guān)性越好。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1批內(nèi)精密度比較 分別采用手工法和全自動(dòng)法檢測(cè)樣本濃度為3.01×106Copies/ml的高值血清樣本和2.54×103Copies/ml的低值血清樣本，均值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），全自動(dòng)法的CV值更小，批內(nèi)精密度更好，具體見表1。

表1 手工法和全自動(dòng)法的批內(nèi)精密度比較

2.2批間精密度比較 分別采用手工法和全自動(dòng)法檢測(cè)樣本濃度為2.11×106Copies/ml，共檢測(cè)23次，均值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），全自動(dòng)法的CV值更小，批間精密度更好，具體見表2。

表2 手工法和全自動(dòng)法的批間精密度比較

2.3正確度比較 分別采用手工法和全自動(dòng)法檢測(cè)濃度為2.0×107Copies/ml、2.0×106Copies/ml、2.0×105Copies/ml、2.0×104Copies/ml、2.0×103Copies/ml的定值血清樣本。結(jié)果顯示，全自動(dòng)法和手法檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，全自動(dòng)法的CV值更小，具體見表3。

表3 手工法和全自動(dòng)法的正確度比較（Copies/ml）

2.4線性范圍比較 分別采用手工法和全自動(dòng)法檢測(cè)濃度為2.58×108Copies/ml、2.58×107Copies/ml、2.58×106Copies/ml、2.58×105Copies/ml、2.58×104Copies/ml、2.58×103Copies/ml定值血清樣本及其稀釋后的樣本進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，兩種方法在檢測(cè)濃度為2.58×103Copies/ml-2.58×108Copies/ml之間線性范圍較好，全自動(dòng)法R2更接近1，優(yōu)于手工法，見表4。

表4 手工法和全自動(dòng)法的線性范圍比較

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一種準(zhǔn)確、快速的核酸定量檢測(cè)技術(shù)，是病原學(xué)檢測(cè)和分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，已廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]。而核酸提取則是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[4]。手工法常常利用煮沸法將病毒的DNA直接從病毒顆粒中釋放出來，離心后的上清液除了含有核酸，還含有一部分干擾物質(zhì)，如血紅蛋白等[5]。手工法也存在一些生物安全隱患，比如氣溶膠[6]等。全自動(dòng)法以磁珠法應(yīng)用最多，適合大批量樣本檢測(cè)[7]。磁珠由于能夠提供最接近天然抗原遞呈細(xì)胞的作用而提高了激活能力，簡(jiǎn)化了核酸提取過程[8]。它的原理是利用磁性硅膠對(duì)DNA的特異性吸附，在磁場(chǎng)的作用下可分離獲得純度較高的病毒DNA。

在本研究中，全自動(dòng)法檢測(cè)高值血清精密度、低值血清精密度的CV值分別為1.88%、2.50%，明顯低于手工法；用2.11×106Copies/ml的高值血清做批間精密度的驗(yàn)證，結(jié)果顯示全自動(dòng)法的CV值為2.70%，明顯低于手工法；用2.0×107Copies/ml、2.0×106Copies/ml、2.0×105Copies/ml、2.0×104Copies/ml、2.0×103Copies/ml的定值血清樣本進(jìn)行兩種核酸提取方法的驗(yàn)證，全自動(dòng)法的偏倚分別為-1.17%、-1.11%、0.63%、0.58%、-0.98%，CV值均低于手工法。這可能是在操作過程中，操作人員的工作習(xí)慣和熟練程度存在差異造成。全自動(dòng)法提取DNA的過程不需要人參與操作，減少了人工操作的污染以及操作過程中的不確定性，避免了因操作帶來的系統(tǒng)誤差[9]。對(duì)兩種操作方法的線性范圍對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，兩種方法在較寬的線性范圍都具有良好的線性；相比較而言，全自動(dòng)法優(yōu)于手工法，能更好地滿足臨床需要，這與馬貞麗[10]、董劍[11]等人的報(bào)道相一致。

全自動(dòng)法和手工法都存在一定優(yōu)缺點(diǎn)。全自動(dòng)法與手工法相較，主要依靠全自動(dòng)核酸提取儀以及配套試劑耗材，成本較高；而手工法操作主要依靠于人，不需要儀器，耗材成本也相對(duì)較低，但也可能存在一些因操作差異而導(dǎo)致的誤差，如高溫分解病原體、高速離心、棄除上層廢液等環(huán)節(jié)易出現(xiàn)交叉污染[12]。另外，檢驗(yàn)日常工作中避免不了儀器故障，檢修常常需要較長(zhǎng)時(shí)間。此時(shí)，手工法就可取而代之。本實(shí)驗(yàn)中兩種檢測(cè)方法都能滿足日常工作需求，但全自動(dòng)法優(yōu)于手工法，手工法可用作全自動(dòng)法出現(xiàn)故障時(shí)的備用。

綜上所述，全自動(dòng)核酸提取法在精密度、正確度、線性范圍等方面均優(yōu)于手工法，簡(jiǎn)化了工作流程，能更好地滿足實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化檢測(cè)工作，值得推廣應(yīng)用。