李韋瑤，鄧嘉強，趙芳芳，朱雪瑞，曹隨忠，沈留紅，余樹民

（四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130）

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是哺乳動物骨髓基質中的一種能自我更新的干細胞，具有多向分化潛能和免疫調控能力[1]，在治療退行性疾病和組織創(chuàng)傷中具有廣闊的應用潛力[2]。當機體受到損傷時，MSCs通過遷移/生成生長因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶和表面黏附分子向靶器官靶組織介導損傷修復和再生。MSCs應用于臨床需要經過體外擴增達到一定數(shù)量，然而MSCs在體外擴增一段時間后不可避免呈現(xiàn)老化，增殖活力和遷移能力下降，嚴重阻礙MSCs在臨床治療中的應用[3]，因此采取一系列措施如天然活性成分，遲滯MSCs老化，增強細胞活力和遷移歸巢能力，成為MSCs臨床應用研究的焦點。

姜黃素（curcumin,Cur）是從姜科及天南星科等植物根莖中提取的一種脂溶性天然活性物質，已有研究顯示姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗纖維化等生物活性，并應用于傷口愈合[4]，以及在消化系統(tǒng)[5]、心血管系統(tǒng)[6]和皮膚[7]等系統(tǒng)疾病的預防和治療中也表現(xiàn)出巨大的潛力。研究發(fā)現(xiàn)在抗肺癌治療中，姜黃素通過上調miR-206表達抑制癌細胞入侵和遷移[8]。近年來，發(fā)現(xiàn)Cur處理可通過降低氧化應激，重塑細胞骨架，提高人臍帶血、人脂肪來源MSC的細胞活力[9-10]。本試驗旨在以犬骨髓來源MSCs(cBMSCs)為材料，研究Cur處理對cBMSCs遷移能力的影響，進而為cBMSCs應用于臨床治療犬相關疾病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

健康中華田園犬（6～12月齡），體質量(10±1)kg，由四川省雅安市流浪狗救助中心提供。

1.2 試劑

LG-DMEM干粉（GIBICO公司）；胎牛血清FBS（北京全式金生物技術有限公司）；青霉素、鏈霉素、胰島素、茜素紅、油紅O染液、1%結晶紫染色液、二甲基亞砜DMSO（Solarbio公司）；β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛（MCE公司）；維生素C、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤IBMX、地塞米松（Sigma公司）；TRAPeze?Kit RT Telomerase Detection Kit與引物（上海生工生物工程股份有限公司）；反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa公司）；胰蛋白酶（Biofroxx公司）姜黃素（HPLC≥98%，Solarbio公司）；DAPI染液、微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green-488，碧云天生物技術有限公司）；24孔板Transwell-膜嵌套（Corning公司）；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。

1.3 犬骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

取6～12月齡犬全身麻醉后，采用肱骨股骨頭穿刺收集骨髓液[11]。加等量的PBS與肝素鈉配制的抗凝液混勻，1 500 r/min離心5 min，重復洗滌2次。將細胞沉淀直接用完全培養(yǎng)液進行懸浮，經血球計數(shù)板計數(shù)，按1×108～109cells/mL的密度接種，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，3 d后半量換液，此后每3～4 d換液一次。待原代細胞培養(yǎng)在多個視野內細胞達至80%～90%融合，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入適量用胰酶消化液于37℃下消化2～3 min，在顯微鏡下觀察到細胞變圓漂浮，加入基礎培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打使細胞充分脫落，轉移至15 mL離心管，1 200 r/min離心8 min，重懸后按1∶3比例傳代，3 d換液1次，隔1 d觀察細胞生長狀態(tài)，每5～7 d傳代1次。

接種細胞（P3）至6孔培養(yǎng)板（3×104cells/mL），待細胞長至90%～100%融合時，分別更換成骨和成脂分化誘導液進行分化誘導，3 d換液1次。成脂誘導14 d后，采用油紅O染色觀橘紅色脂肪顆粒；成骨誘導21 d后，采用茜素紅染色觀察鈣化結節(jié)。

1.4 細胞分組與姜黃素處理

取同批次的第3代（P3）cBMSCs和第6代（P6）cBMSCs進行接種培養(yǎng)，待細胞貼壁后對P6-cBM?SCs添加Cur（0、0.1、1和10 μmol/L）預處理24 h，分別設置 P3-cBMSCs為P3組和P6-cBMSCs+Cur（0、0.1、1和10 μmol/L）為姜黃素處理組。

1.4.1 細胞劃痕實驗

按2×105cells/孔接種細胞，每孔設置3個重復，待細胞鋪滿板底后用10 μL槍頭對同一批次來源P3-cBMSCs和P6-cBMSCs垂直劃痕，采集初始劃痕照片。按1.4處理細胞，細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察和評估劃痕愈合情況后取樣拍照，每孔按上下左右4個方向分別采集4個視野，應用Image Pro Plus 6.0（IPP）對細胞遷移面積進行定量分析，計算細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=[（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積]×100%。

1.4.2 Transwell細胞遷移實驗

取孔徑為8 μm的24孔Transwell板，分別將上室與下室加入少許基礎培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱溫育1 h，以充分浸潤聚碳酸酯膜。按1.4處理cBMSCs后經胰酶消化后離心收集，PBS洗滌2次，用無血清的DMEM以1×105cells/mL懸浮細胞，取溫育后的Transwell板，棄去培養(yǎng)液，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入800 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，每組設置3個復孔。置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，用DAPI法對小室外表面進行染色，于熒光顯微鏡下觀察拍照（每孔隨機4個視野），并通過Im?age J統(tǒng)計計數(shù)。

1.4.3 微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green-488）觀察細胞質骨架

細胞按1×104cells/孔的密度接種至12孔板，每組設置3個復孔，按1.4處理cBMSCs，PBS洗滌細胞2次后用4%多聚甲醛固定液固定15 min，再用含0.1%Triton X-100的PBS洗滌細胞3次，每次3～5 min，加入現(xiàn)配的染色工作液（250 μL/孔），室溫避光孵育45 min，0.1%的Triton X-100的PBS洗滌2次，每次3～5 min，再加入DAPI染色液染色15 min，經PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察到細胞被綠色熒光探針標記染色后拍照記錄。

1.4.4 RT-qPCR檢測細胞遷移相關基因表達

基于上述試驗，采用Trizol法提取細胞總RNA，將已獲取的RNA逆轉錄為cDNA。以反轉錄后的cDNA為模板，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（引物序列及參數(shù)見表1），進行熒光定量PCR反應。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 The primer sequences used for RT-qPCR

1.4.5 細胞壞死與凋亡檢測

分別收集姜黃素處理組細胞約1×105cells于1.5 mL離心管內，離心棄上清。細胞沉淀用細胞染色緩沖液重懸。分別加入5 μL Hoechst染色液和PI染色液，混勻，4℃孵育20～30 min。用PBS洗滌1次，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光和藍色熒光，拍照記錄。

1.4.6 細胞相對端粒長度檢測

提取姜黃素處理組細胞基因組DNA，核酸蛋白分析儀測定所提取DNA的純度和濃度，將DNA梯度稀釋，制作標準曲線。通過RT-qPCR獲取端粒（Tel）和36B4的Ct值。以log（ng DNA）為橫坐標，Ct值為縱坐標，分別制作端粒和36B4的標準曲線。將待測樣品DNA以相同反應體系和反應條件進行RTq-PCR反應。將所測樣品端粒的Ct值代入到端粒標準曲線方程中，得出相應Ct值對應的ng DNA值，即T值。將所測樣品36B4基因的Ct值代入到36B4標準曲線方程中，得出相應Ct值對應的ngDNA值，即S值。同一個樣品的T值與S值的比值（T/S）即為該樣品的相對端粒長度，36B4和Tel引物序列見表1[12]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和配對t檢驗，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（±s），插圖通過GraphPad Prism 7.0軟件進行排版和整理，P<0.05表示差異顯著（用“*”表示），P<0.01表示差異極顯著（用“**”表示）。

2 結果與分析

2.1 犬骨髓間充質干細胞的傳代培養(yǎng)與鑒定

將cBSMCs體外培養(yǎng)，細胞傳至第3代在倒置顯微鏡下呈梭形、紡錘狀，輪廓清晰，折光性強，具有良好的增殖特性；相比于第3代，細胞傳至第6代時部分出現(xiàn)衰老變形、細胞輪廓不清晰，胞漿逐漸出現(xiàn)細微顆粒，增殖速度減慢的現(xiàn)象；傳至第9代，幾乎所有細胞均呈現(xiàn)老化特征，且細胞處于生長停滯狀態(tài)（圖1）。

圖1 體外傳代細胞形態(tài)學特征Figure 1 The morphology of BMSCs in vitro expansion(scale bar=100 μm).

對cBMSCs分別進行成脂和成骨分化誘導，14 d后采用油紅O染色后觀察到細胞內的橘紅色的脂肪顆粒(圖2A)，成骨誘導21 d后茜素紅染色觀察到紅色鈣化結節(jié)（圖2B），表明cBMSCs能夠向脂肪細胞和成骨細胞分化，具有MSCs的特性。

圖2 cBMSCs成脂和成骨分化特性Figure 2 Adipogenic and osteogenic differentiation characteristics of cBMSCs.(scale bar=100 μm)

2.2 姜黃素對犬骨髓間充質干細胞遷移、侵襲的影響

細胞劃痕實驗結果顯示（圖3A），相比P3組，P6-cBMSCs的劃痕愈合率顯著下降[（49.48±13.00）%vs（69.54±6.33）%，P<0.01]，cBMSCs遷移能力在傳代過程中受損。姜黃素處理后，P6-cBMSCs的愈合率顯著提高[(65.85±11.16)%vs(49.5±13.0)%，P<0.01；(71.44±8.66)%vs(49.5±13.0)% ，P<0.01;(60.92±10.87)%vs(49.5±13.0)%，P<0.05]，其中添加1 μmol/L濃度的Cur細胞愈合效果最佳。

圖3 姜黃素對犬骨髓間充質干細胞遷移、侵襲的影響Figure 3 Effects of curcumin on migration and invasion of cBMSCs.(scale bar=100 μm)

Transwell細胞遷移實驗結果顯示（圖3B），相比于P3組，P6-cBMSCs穿透至下層的數(shù)量cBMSCs明顯減少（61.75±8.67 vs 115.58±14.11，P<0.01）。姜黃素處理后，P6-cBMSCs遷移數(shù)量均極顯著增多（88.75±10.18 vs 61.75±8.67；106.42±6.99 vs 61.75±8.67；78.58±6.75 vs 61.75±8.67，P<0.01），其 中1 μmol/L濃度的Cur作用效果為最佳。

細胞形態(tài)維持、內部結構合理以及遷移運動都與細胞質骨架密切相關。微絲綠色熒光探針染色結果顯示，P3組cBMSCs充分貼壁鋪展，可以觀察到形態(tài)挺直的應力纖維和絲狀偽足結構，P6-cBMSCs圓合度較高，應力纖維彎曲且稀少，姜黃素處理后cBMSCs可見應力纖維增多（圖3C）。

RT-qPCR檢測3種與cBMSCs遷移相關的因子（MMP-2、MMP-9和CXCL8）的轉錄水平。結果顯示，相比P3組，P6-cBMSCs的MMP-2和MMP-9基因轉錄水平極顯著下調（P<0.01），而CXCL8的表達沒有顯著差異。經姜黃素處理后，MMP-2和CXCL8的表達均極顯著上調（P<0.01），MMP-9的表達上調，但差異不顯著（圖3D）。綜上，Cur的處理能顯著提高cBMSCs的遷移能力。

2.3 姜黃素對犬骨髓間充質干細胞壞死與凋亡和相對端粒長度的影響

細胞壞死與凋亡檢測結果顯示，P6-cBMSCs經姜黃素處理后凋亡和壞死細胞比例有所下降，表明Cur一定程度上維持cBMSCs的細胞活力，延緩凋亡和壞死(圖4A)。細胞相對端粒長度檢測結果顯示，姜黃素能延緩相對端粒長度的縮短，其中1 μmol/L濃度的Cur作用顯著（P<0.05）(圖4B)。綜上，Cur處理能抑制cBMSCs凋亡，遲滯相對端粒長度縮短。

圖4 姜黃素對犬骨髓間充質干細胞凋亡和相對端粒長度的影響Figure 4 Effects of curcumin on necrosis,apoptosis and relative telomere length of cBMSCs

3 討論與結論

本試驗采集犬骨髓通過細胞貼壁法分離cBM?SCs，根據(jù)細胞形態(tài)和分化試驗，顯示所分離細胞具有文獻報道的cBMSCs特點[11]。大量研究發(fā)現(xiàn)MSCs隨著傳代次數(shù)的增加而衰老，表現(xiàn)細胞活力、遷移能力和分化潛能下降，更傾向于分化為脂肪細胞，成骨分化潛能減弱，免疫調節(jié)功能異常[13]，而老化MSCs移植后絕大多數(shù)在24 h即死亡[14]。同樣，本試驗所分離cBMSCs培養(yǎng)至P6代就呈現(xiàn)體積增大，扁平輪廓不清，細胞活力降低等老化表型，其遷移能力相應減弱。

細胞的遷移能力是MSCs活力和歸巢能力的重要體現(xiàn)，為MSCs介導組織修復再生所必需，目前在移植前多采用低氧和一些活性物質等進行預處理提高MSCs活力和遷移能力，進而提高臨床治療的效力[15]。最近的研究顯示，1 μg/mL Cur處理使人臍帶血來源MSCs（HUMSCs）遷移能力顯著增強，尤其納米負載的Cur其生物學作用大大增強，并證實其促遷移作用與細胞骨架重塑密切相關[9]；同樣，H.Ghufran[10]等在研究用姜黃素預處理人脂肪干細胞（hASCs）在抗高血糖應激的作用中發(fā)現(xiàn)，Cur（5 μmol/L）預處理24 h可以改善hASCs的遷移能力。本試驗以呈現(xiàn)衰老表型的P6代cBMSCs為材料，細胞劃痕實驗、Transwell實驗均顯示1 μmol/L姜黃素處理顯著增強cBMSCs遷移能力，即劃痕愈合率顯著上升，而遷移至Transwell小室外表面的細胞數(shù)量顯著增加，細胞應力纖維數(shù)量和排列得到改善。已有研究證實，基質金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）和趨化因子CXCL-8參與細胞遷移過程[16-17]，王俊等[18]發(fā)現(xiàn)川芎嗪上調MSCs的MMP-2、MMP-9表達,促進BMSCs遷移。本研究同樣顯示，Cur能上調遷移相關因子（MMP-2、MMP-9和CXCL8）的基因表達水平，促進cBMSCs的遷移。

MSCs作為有絲分裂細胞，端粒長度隨著細胞擴增培養(yǎng)逐漸縮短，逐漸失去細胞活力，最終進入到不可逆轉的衰老狀態(tài)[19]。Deng J.等[20]發(fā)現(xiàn)Cur（1 μmol/L）能夠有效維持細胞活力，改善體外復制性衰老cBMSCs的衰老表型和遷移能力損傷。本研究中，我們通過凋亡與壞死試劑盒以及相對端粒長短檢測來進一步評估Cur對cBMSCs活力的影響。結果顯示，Cur可以降低細胞凋亡和壞死程度，延緩端粒長度縮短，進而保持細胞活力和延緩細胞衰老，這可能是改善MSCs遷移能力的重要基礎。

綜上，1 μmol/L濃度Cur可以增加cBMSCs細胞微絲生成，上調基質金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）和趨化因子CXCL8的表達，延緩端粒長度縮短，改善衰老cBMSCs的遷移能力。