程 媛，馬朋濤，武 晶

（1.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

普通菜豆(Phaseolus vulgarisL.)又稱蕓豆、四季豆，屬豆科、菜豆屬作物，是食用人群最多的食用豆類。普通菜豆籽粒富含鐵、鈣、鎂、錳和鉀等礦物質(zhì)元素[1]，具有高蛋白、中淀粉、低脂肪以及營養(yǎng)元素豐富等特點，是人類飲食中植物蛋白的重要來源[2]，深受消費者的喜愛。普通菜豆在l5世紀從歐洲引入中國，已有500多年的栽培歷史[3]。目前，中國種植的普通菜豆大多為地方品種，主要分布于云南、貴州、山西、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古和黑龍江等省區(qū)[4]，是中國主要的出口創(chuàng)匯商品之一[5]。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種生物技術(shù)手段，徹底打破了常規(guī)育種中物種間的限制，實現(xiàn)了不同物種之間遺傳物質(zhì)的重組。再生系統(tǒng)的建立是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵步驟，而普通菜豆是菜豆屬中再生和遺傳轉(zhuǎn)化最困難的作物[6]。在1976年O.J.Crocomo等[7]首次獲得了2株普通菜豆再生植株，隨后對普通菜豆的大量再生研究表明其存在兩種再生途徑：器官發(fā)生途徑和體細胞發(fā)生途徑[8]。其中，器官發(fā)生途徑包括直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑。

目前，建立的普通菜豆再生體系大部分是直接器官發(fā)生途徑。直接器官發(fā)生途徑是不經(jīng)過愈傷組織形成階段，直接從外植體的葉肉細胞、表層細胞或分生組織誘導形成不定芽。例如，M.Santalla等[9]挑選出10個優(yōu)良品種和7個地方品種，將胚軸作為外植體進行再生試驗，得到了再生植株。M.H.Cruz等[10]利用14 d齡菜豆植株的橫向薄細胞層實現(xiàn)了高頻率的再生。P.Delgado-Sa′nchez等[11]利用成熟種子胚軸對兩個商業(yè)菜豆品種實現(xiàn)了有效再生。此外，普通菜豆的再生體系還有子葉節(jié)再生體系[12]、芽頂端分生組織再生體系[13]、幼葉的葉柄再生體系等[14]。由于不同類型外植體生理狀態(tài)差異，對于外界誘導、分化和再生能力有所不同[15]。M.Saxena[16]比較了不同外植體的再生效率，發(fā)現(xiàn)帶腋芽的子葉節(jié)、葉柄和子葉節(jié)的再生效率分別為78%、62%和82%。2021年Yu Y.等[17]將子葉節(jié)、胚軸和根段作為外植體進行普通菜豆再生試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用胚軸的再生芽率達74.21%，高于另外兩種外植體的再生芽率。然而，關(guān)于普通菜豆間接器官發(fā)生途徑報道很少。間接器官發(fā)生途徑是通過脫分化形成愈傷組織再分化成植株。M.F.Mohamed等[18]首次利用花梗作為外植體誘導愈傷組織，獲得了再生植株；M.A.Zambre等[19]從普通菜豆育種品系Xan-159的子葉和胚軸誘導愈傷組織，發(fā)現(xiàn)從子葉誘導愈傷組織上獲得了可育的再生植株，再生效率達39%。J.Arellano等[20]將子葉節(jié)作為外植體，在含有0.34 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上誘導愈傷組織再生出芽，再生芽效率達50%左右。隨后，R.Collado等[21]利用不同的外植體誘導愈傷組織，并且測定了不同濃度的TDZ和BAP對愈傷組織誘導再生芽的影響，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加2.25或4.50 mg/L的BAP的培養(yǎng)基再生效果最佳，建立了一種可以應用于5種類型的普通菜豆的間接器官再生系統(tǒng)。Yu Y.等[17]發(fā)現(xiàn)添加0.5 mg/L的TDZ誘導愈傷組織能力最強，誘導率達到91.51%，在芽誘導培養(yǎng)基上添加1.0 mg/L的BAP后，芽再生頻率高達93.33%。

與器官發(fā)生途徑相比，采用體細胞發(fā)生途徑對普通菜豆進行再生的報道較少。A.Allavena[22]和S.Martins等[23]分別從普通菜豆未成熟合子胚的小葉和頂芽誘導的愈傷組織中獲得了胚狀體，但后續(xù)均未得到發(fā)育。多年后，L.R.García等[8]從胚性愈傷組織中獲得再生植株，再生效率達32%，并且發(fā)現(xiàn)體細胞胚的形成和萌發(fā)取決于外植體、培養(yǎng)基和光照條件。隨后，J.L.Cabrera-ponce等[24]在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素（BAP），結(jié)合滲透脅迫誘導獲得不同階段的體細胞胚，并分化形成了完整植株。

本試驗擬通過直接器官再生途徑將帶有子葉節(jié)的胚軸作為外植體進行再生試驗，篩選高再生芽率的基因型，為建立普通菜豆遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料

普通菜豆經(jīng)過長期馴化和地理隔離，形成了安第斯和中美洲兩個多樣性中心[25]。兩個中心的普通菜豆在形態(tài)特征方面存在明顯的差異，安第斯中心的普通菜豆籽粒大(百粒重>40 g)；而中美洲中心材料為中小籽粒（≤40 g）[26]。據(jù)報道，普通菜豆大粒品種再生十分困難[27]。因此，本試驗從中美洲基因庫中選取17份普通菜豆種質(zhì)資源，從安第斯基因庫中選取兩份，總共19個品種，由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供（表1、圖1）。

表1 所用普通菜豆詳細信息Table 1 Details of the common beans used

圖1 19份普通菜豆材料籽粒形態(tài)Figure 1 Grain morphology of 19 common beans

1.1.2 培養(yǎng)基

試驗所用的培養(yǎng)基（表2）需經(jīng)過121℃、0.12 MPa高壓滅菌20 min，冷卻至50℃～60℃時在無菌條件下加入激素（激素需經(jīng)過濾器除菌），混勻，備用。

表2 試驗所用培養(yǎng)基Table 2 Medium used in the experiment

1.2 試驗方法

1.2.1 種子滅菌

采用氯氣滅菌法。選取表面光滑、無病害且大小一致的普通菜豆種子于培養(yǎng)皿中。分散開以保證滅菌充足，培養(yǎng)皿敞開放在通風櫥中的干燥器中，采用100 mL HClO+4 mL HCl氯氣法進行滅菌18 h。

1.2.2 外植體的獲得

外植體的獲取參考Che P.等[28]的方法，并稍作改動。將無菌種子平放于發(fā)芽培養(yǎng)基上萌發(fā)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照18 h。當萌發(fā)的胚軸2～3 cm時獲得無菌苗。不同品種萌發(fā)至相同狀態(tài)時，統(tǒng)計不同基因型的發(fā)芽率。然后將萌發(fā)好的種子切除子葉、頂芽和胚根，只保留1～2 cm的胚軸及子葉節(jié)部位，即可獲得外植體。

1.2.3 不定芽的誘導

將獲得的外植體平放于芽誘導培養(yǎng)基上，25℃，光照18 h進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第2周時觀察再生芽狀態(tài)，切除下胚軸處褐色愈傷并進行繼代處理。培養(yǎng)第5周時統(tǒng)計不同基因型的再生芽株數(shù)及個數(shù)，計算再生芽率以及平均再生芽個數(shù)。

1.2.4 不定根的誘導及再生植株的形成

芽誘導結(jié)束后，將≥1 cm的再生芽接種在生根培養(yǎng)基上。待其長出主根，煉苗2 d后，移栽于土中培養(yǎng)，繼而獲得再生植株。

1.2.5 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

發(fā)芽率=發(fā)芽粒數(shù)/接種總粒數(shù)×100%，再生芽率=再生芽株數(shù)/接種外植體數(shù)×100%，再生芽數(shù)=再生芽總個數(shù)/再生芽株數(shù)，再生芽株數(shù)是再生芽大于等于1 cm的株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型發(fā)芽率的比較

種子萌發(fā)是再生過程中的第一步，發(fā)芽率決定著生長過程中品質(zhì)優(yōu)劣情況，是再生過程中一個重要的指標，因此首先對19份不同基因型的普通菜豆進行萌發(fā)試驗。種子經(jīng)過氯氣滅菌處理后，平放于發(fā)芽培養(yǎng)基上進行萌發(fā)。試驗發(fā)現(xiàn)不同基因型的普通菜豆發(fā)芽率存在差異，19份普通菜豆平均發(fā)芽率為87.4%，達90.0%以上的為細白羊角豆、BAT1198、F0003370、Preto Catarinense、IAPAR 57、Ouro Branco、F0005919、Michelite、Garbancillo Zarco、ICA Pijao、HR45、龍蕓豆12和龍蕓豆17等13個品種。其中，BAT1198、F0005919、Michelite、Garban?cillo Zarco、HR45和龍蕓豆12發(fā)芽率達100%，BAT93、灰蘭刀豆、英國紅蕓豆、黑蕓豆、龍蕓豆7號以及Centa Cuscatleco的發(fā)芽率低于平均值，并且F0004313的發(fā)芽率最低，僅為27.5%（圖2）。同時，不同基因型的普通菜豆發(fā)芽速率不同，大粒品種發(fā)芽速率低于小粒品種，小粒品種5～6 d萌發(fā)至需要的狀態(tài)（圖3a），而大粒品種萌發(fā)到相同的狀態(tài)需更長的時間，10～15 d。

圖2 不同基因型普通菜豆發(fā)芽率Figure 2 The germination rate of common beans of different genotypes

圖3 再生體系的關(guān)鍵技術(shù)流程Figure 3 Key technical process of the regeneration system

發(fā)芽率不同可能是因為種皮的硬度不同影響種子的吸水程度，種皮較硬的種子難以吸脹，影響發(fā)芽率。此外，種皮顏色對種子的萌發(fā)也有一定的影響，白色種皮的籽粒萌發(fā)能力較強，如BAT1198、Garbancillo Zarco和龍蕓豆12等。

2.2 不同基因型菜豆再生形態(tài)分析

將獲得的外植體平放于芽誘導培養(yǎng)基上（圖3b），在相同條件下對19份普通菜豆進行芽誘導試驗。芽誘導第二周時發(fā)現(xiàn)下胚軸處有愈傷生成，子葉節(jié)處伴有較小的再生芽長出（圖3c），進行繼代處理。在第5周時下胚軸愈傷膨大，再生芽伸長（圖3d）?？捎^察到不同基因型普通菜豆再生芽的形態(tài)、長勢情況也存在明顯差異（圖4）。BAT93、灰蘭刀豆、F0003370、英國紅蕓豆、黑蕓豆、IAPAR 57、Ouro Branco、龍蕓豆 7 號、Garbancillo、ICA Pijao、龍蕓豆17和HR45這12份材料再生芽較小（<1.5 cm），其中BAT93、英國紅蕓豆、Ouro Branco和HR45這4份材料在胚軸頂端伴隨著叢芽生成。而細白羊角豆 、BAT1198、Preto Catarinense、F0005919、Michelite、Centa Cuscatleco和龍蕓豆12等共7份材料再生芽較大（≥1.5 cm）。

圖4 19份材料再生5周后狀態(tài)Figure 4 19 materials status after 5 weeks of regeneration

2.3 不同基因型普通菜豆再生芽率和再生芽數(shù)分析

對19份普通菜豆進行2次重復再生試驗發(fā)現(xiàn)，不同基因型的普通菜豆在相同條件中芽誘導效果差異顯著。對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析，19份材料總平均再生芽率為56.8%。其中有8份材料平均再生芽率高于總平均再生芽率，從高到低依次為細白羊角豆、Ouro Branco、ICA Pijao、Garbancillo Zarco、F0005919、HR45、Centa Cuscatleco和龍蕓豆12。細白羊角豆再生效果明顯，再生芽率高達94.4%，平均再生芽率為90.8%。其次是Ouro Branco，平均再生芽率87.1%，而英國紅蕓豆再生芽率最低（表3）。統(tǒng)計再生芽株數(shù)和個數(shù)，計算平均再生芽個數(shù)發(fā)現(xiàn)，19份材料再生芽數(shù)差異不明顯。每株再生芽個數(shù)在0～3個之間，平均再生芽個數(shù)在1.00～2.00個之間，相比較而言細白羊角豆再生芽個數(shù)較多，平均再生芽數(shù)為1.54個。

表3 19份材料再生芽率、平均再生芽數(shù)的比較Table 3 Comparison of regeneration bud rate and average number of regenerated

2.4 不同基因型普通菜豆生根能力及再生能力分析

將長出的再生芽從基部切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，進行生根試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)再生芽越大，生根速率越快，再生苗成活率也越高，大約30 d能長出茁壯的根系。反之，再生芽越小，生根越困難，形成的根系也越少。與此同時，還發(fā)現(xiàn)基因型對于生根沒有直接影響，每個基因型較大的再生芽均能生根（圖3e），而與再生芽的大小、茁壯程度有直接關(guān)系。當組培苗產(chǎn)生2～3個主根時，煉苗2 d，洗去培養(yǎng)基后移至土中培養(yǎng)大約60 d能結(jié)莢（圖3f）。

對19份材料進行兩次重復再生試驗，發(fā)現(xiàn)細白羊角豆萌發(fā)能力強，發(fā)芽率高。再生過程中再生芽較大、較壯，再生芽率高達94.4%，平均再生芽率為90.8%，平均再生芽個數(shù)達1.54個，生根能力較強，與其他品種比較，再生效果顯著。對多重數(shù)據(jù)進行分析認為細白羊角豆在19份材料中再生能力最強。初步認為細白羊角豆是這19份材料中最適宜的普通菜豆再生品種。

3 討論與結(jié)論

目前，普通菜豆遺傳轉(zhuǎn)化體系還處在探索階段，影響其轉(zhuǎn)化效率的因素很多，其中高效穩(wěn)定的再生體系是構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵一環(huán)。植物器官的分化與再生依賴于基因型，因此篩選再生能力較強的基因型是高效誘導普通菜豆再生植株的關(guān)鍵，也是普通菜豆高效再生體系建立的前提。

本論文對19份不同普通菜豆基因型的再生能力進行比較分析，發(fā)現(xiàn)細白羊角豆的再生能力較好，為94.4%。K.A.Malik等[29]對6種不同基因型的普通菜豆進行再生試驗，發(fā)現(xiàn)不同基因型的普通菜豆再生芽率存在差異。P.Delgado-sanchez等[30]將胚軸作為外植體，研究Flor de Junio Marcela（FJM）和Flor de Mayo Anita（FMA）這兩個普通菜豆品種的再生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FJM再生芽率達83.0%，而FMA再生芽率僅為50.0%。G.Mukeshimana等[31]優(yōu)化再生體系對4個普通菜豆品種進行再生試驗，其中Merlot再生芽率最高，為93.0%，而Zorro再生芽率僅為67.0%。大多數(shù)普通菜豆品種再生十分困難，尤其是大粒品種[32]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，大粒品種英國紅蕓豆再生困難，再生芽率最低，為22.2%，而小粒品種細白羊角豆再生芽率最高為94.4%。本研究結(jié)果進一步說明不同基因型普通菜豆再生能力差異顯著，在后續(xù)進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗之前篩選合適的基因型是必要的。細白羊角豆具有較高的再生芽率，此基因型可以作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化研究的受體材料，希望通過農(nóng)桿菌介導法獲得普通菜豆轉(zhuǎn)基因植株，并為后續(xù)的基因功能驗證奠定基礎(chǔ)。