陳靈， 蔣文婕， 姚昶， 李玉蓮， 方明明

結(jié)腸癌是一種由諸多因素誘發(fā)的結(jié)腸上皮來(lái)源消化道腫瘤，其發(fā)病早期無(wú)明顯癥狀，但隨著疾病進(jìn)展，可能引起多種并發(fā)癥如器官功能障礙、頭暈頭痛、黃疸、呼吸困難等[1-2]。目前，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率及致死率逐漸上升，嚴(yán)重影響居民的生存質(zhì)量及生活品質(zhì)[3]。手術(shù)、化療等為當(dāng)前臨床治療結(jié)腸癌的常規(guī)治療方法，但仍存在復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)大、成本高等缺點(diǎn)[2]。諸多證據(jù)顯示，部分中藥及其成分可發(fā)揮抗腫瘤作用，具有療效確切和安全性高等特點(diǎn)[4]。傳統(tǒng)中藥忍冬藤又名老翁須、千金藤，藥用歷史十分悠久，最早記載于漢末的《名醫(yī)別錄》，其性甘味寒，尤善清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)[5]。忍冬藤中含有有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)等多種類(lèi)型代謝產(chǎn)物，可通過(guò)多種途徑，作用于多種靶點(diǎn)，發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用[6]。忍冬藤包括其活性成分對(duì)多種腫瘤亦有作用，但目前暫無(wú)其抗結(jié)腸癌作用的相關(guān)報(bào)道[5-7]。因此，本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480為對(duì)象，從線粒體凋亡角度研究忍冬藤提取物的抗結(jié)腸癌作用，以期為忍冬藤及其組方臨床用于治療結(jié)腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 購(gòu)自ATCC的HCT116和SW480細(xì)胞株(人結(jié)腸癌)采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2 藥物及試劑 忍冬藤(批號(hào)：200911)，購(gòu)自南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，其基原經(jīng)姚昶教授鑒定為忍冬科忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥莖枝；DMSO(批號(hào)：V900090)、DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：D6429)、AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒(批號(hào)：APOAF)，均購(gòu)自德國(guó)默克sigma-aldrich公司；CCK8試劑盒(批號(hào)：CA1210)，購(gòu)自北京索萊寶公司；JC-1檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BL711A)，購(gòu)自合肥白鯊公司；胎牛血清(批號(hào)：10099141C)、PVDF膜(批號(hào)：LC2002)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：23246)，均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；一抗：Bcl-2(批號(hào)：bs-33411R)、Bax(批號(hào)：bs-0127R)、Cleaved Caspase-3(批號(hào)：bsm-33199M)、Cyt-C(批號(hào)：bs-0013R)、Cleaved PARP(批號(hào)：bsm-52408R)、p53(批號(hào)：bsm-33058M)和GAPDH(批號(hào)：bs-0755R)和二抗：IgG-HRP(批號(hào)：32935S)，均購(gòu)自北京博奧森公司；p53抑制劑PFT-α(批號(hào)：SY1065)，購(gòu)自北京百奧萊博。

1.3 主要儀器 ML-TS型電子天平，美國(guó)Mettler Toliedo公司；YK-1020型超聲機(jī)，上海櫻科設(shè)備有限公司；R-100型旋蒸儀，瑞士布奇公司；FD-250201型凍干機(jī)，杭州富瑞捷公司；CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)IRM公司；E2-20TJ型水系統(tǒng)，南京EPED有限公司；TS100、TS2R型顯微鏡，日本尼康公司；Calibur型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；MINI-4小型垂直電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

2 方法

2.1 忍冬藤提取物的制備 結(jié)合文獻(xiàn)及前期基礎(chǔ)[5]，忍冬藤提取物的提取工藝為：取適量忍冬藤藥材(粉碎，40目篩)，加入甲醇(50%，2倍體積)，靜置1 h后超聲50 min，濾渣重復(fù)上述操作，合并兩次濾液，濃縮揮干甲醇后凍干，隨后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)溶，得到生藥濃度為1 g/ml的忍冬藤提取物，臨用前以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。

2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116和SW480細(xì)胞接種于96孔板中(100 μl，5×103個(gè))，24 h后各加入濃度為0(0.1% DMSO)、2、5、10、20、40、60和80 g/L“2.1項(xiàng)”忍冬藤提取物。24 h后按CCK8說(shuō)明書(shū)步驟操作，在450 nm處測(cè)定吸光值并計(jì)算存活率，計(jì)算方法與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。

2.3 Hochest法檢測(cè)凋亡 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116和SW480細(xì)胞接種于24孔板中(500 μl，2.5×104個(gè))，24 h后結(jié)合“2.2項(xiàng)”結(jié)果各加入濃度為0(0.1% DMSO)、15、25和35 g/L“2.1項(xiàng)”忍冬藤提取物。24 h后棄液，PBS洗滌3次，加入300 μl染液，避光孵育10 min后PBS洗滌2次，隨后加入300 μl PBS，最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細(xì)胞并拍照。

2.4 Annexin V/PI法檢測(cè)凋亡率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞接種于6孔板中(2 ml，4×105個(gè))，24 h后處理同“2.3項(xiàng)”，在此基礎(chǔ)上增加0(0.1% DMSO)、35 g/L“2.1項(xiàng)”忍冬藤提取物、35 g/L忍冬藤提取物與5 μmol/L p53抑制劑PFT-α聯(lián)用處理。24 h后依據(jù)凋亡雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟處理，最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后的細(xì)胞凋亡情況。

2.5 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位變化 細(xì)胞培養(yǎng)及接種同“2.2項(xiàng)”，細(xì)胞處理同“2.3項(xiàng)”。24 h后依據(jù)JC-1試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟處理，最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細(xì)胞并拍照。

2.6 Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及接種同“2.4項(xiàng)”，細(xì)胞處理同“2.3項(xiàng)”。24 h后提取總蛋白，按BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟定量，按每孔30 μg蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液(0.1% TBST配制)封閉2 h。0.1% TBST 1∶1 000稀釋相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，0.1% TBST潤(rùn)洗。0.1% TBST 1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，0.1% TBST潤(rùn)洗。加入顯影液，反應(yīng)結(jié)束后吸干顯影液。曝光、顯影并掃描圖像。最后導(dǎo)入相應(yīng)分析軟件分析并計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 忍冬藤提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，忍冬藤提取物干預(yù)24 h后，HCTII6和SW480細(xì)胞存活率明顯下降，并且該效果呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。24 h后的IC50值分別為25.34和37.53 g/L。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇IC50附近的15、25和35 g/L為忍冬藤提取物的實(shí)驗(yàn)濃度。這一結(jié)果亦表明HCT116細(xì)胞較SW480細(xì)胞對(duì)忍冬藤提取物更為敏感，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要選擇HCT116細(xì)胞進(jìn)行深入探討。

圖1 忍冬藤提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響

3.2 忍冬藤提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)的影響 如圖2所示，空白組HCT116和SW480細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為有觸角不規(guī)則形；隨著忍冬藤提取物的干預(yù)，部分細(xì)胞變成折光率更高的類(lèi)圓形，體積縮小并與周?chē)?xì)胞脫離。結(jié)果表明，忍冬藤提取物可對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。

圖2 忍冬藤提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

3.3 忍冬藤提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響 如圖3所示，空白組HCT116和SW480細(xì)胞核表現(xiàn)狀態(tài)正常；隨著忍冬藤提取物的干預(yù)，HCT116和SW480細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征(濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光)。結(jié)果表明，忍冬藤提取物可誘導(dǎo)HCT116和SW480細(xì)胞凋亡。

圖3 忍冬藤提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，相較于空白組，忍冬藤提取物干預(yù)后，HCT116細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。結(jié)果表明，忍冬藤提取物可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡。

注：相較于空白組(Control)，**P<0.01

3.4 忍冬藤提取物對(duì)HCT116細(xì)胞線粒體膜電位的影響 如圖5所示，空白組HCT116細(xì)胞紅色熒光較強(qiáng)；隨著忍冬藤提取物的干預(yù)，HCT116細(xì)胞紅色熒光逐漸變?nèi)酰G色熒光逐漸加強(qiáng)，Merge亦呈現(xiàn)變綠趨勢(shì)。結(jié)果表明，忍冬藤提取物可促進(jìn)HCT116細(xì)胞線粒體膜電位坍塌。

圖5 忍冬藤提取物對(duì)HCT116細(xì)胞線粒體膜電位的影響

3.5 忍冬藤提取物對(duì)HCT116細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)及p53蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，相較空白組，忍冬藤提取物干預(yù)后，HCT116細(xì)胞Bax/Bcl-2比值明顯上調(diào)(P<0.01)，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Cyt-C和p53蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明，忍冬藤提取物可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡。

注：相較于空白組(Control)，*P<0.05，**P<0.01

3.6 p53抑制劑PFT-α對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響 為了驗(yàn)證忍冬藤提取物是否通過(guò)調(diào)控p53依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的凋亡，選用p53抑制劑5 μmol/L PFT-α與35 g/L忍冬藤提取物聯(lián)用。如圖7所示，相較于忍冬藤提取物組，PFT-α可明顯逆轉(zhuǎn)忍冬藤提取物誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞凋亡(P<0.01)。

注：相較于空白組(Control)，**P<0.01；相較于忍冬藤提取物組，##P<0.01

4 討論

我國(guó)絕大多數(shù)傳統(tǒng)中藥來(lái)源于藥用植物，其原植物的初生和次生代謝產(chǎn)物十分復(fù)雜，這種復(fù)雜性體現(xiàn)在代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型各不相同，復(fù)雜的代謝產(chǎn)物正是中藥發(fā)揮多種藥理作用和多方面功效的重要基礎(chǔ)[8]。忍冬藤中含有綠原酸、異綠原酸等有機(jī)酸類(lèi)，木犀草素、木犀草苷、槲皮素等黃酮類(lèi)，斷氧馬錢(qián)苷、獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜類(lèi)等多種類(lèi)型代謝產(chǎn)物[6]。據(jù)報(bào)道，綠原酸可通過(guò)IFN-γ信號(hào)通路抑制食管癌體內(nèi)及體外模型的PD-L1的表達(dá)，從而發(fā)揮抗食管癌作用[9]。木犀草素可通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路H3K27Ac和H3K56Ac的水平調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)，從而抑制受體陽(yáng)性的三陰性乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。獐牙菜苷可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體凋亡、干預(yù)細(xì)胞周期和靶向JNK/p38信號(hào)通路，最終獲得抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用[11]。以上可知，忍冬藤及其代謝產(chǎn)物可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究中，忍冬藤提取物可劑量依賴地抑制HCT116和SW480細(xì)胞增殖并改變其細(xì)胞形態(tài)。因此，忍冬藤提取物具有明確的體外抗結(jié)腸癌作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞通過(guò)激活多種基因并促進(jìn)其表達(dá)，最終有序結(jié)束自身生命的一種程序性死亡方式[12]。同時(shí)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序是大部分臨床一線化療藥物包括順鉑、奧沙利鉑等發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑[13]。在本研究中，忍冬藤提取物可誘導(dǎo)HCT116和SW480細(xì)胞凋亡。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)忍冬藤提取物能夠劑量依賴地誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示，誘導(dǎo)凋亡可能是忍冬藤提取物抗結(jié)腸癌作用的重要途徑。

線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要途徑之一，線粒體膜電位的坍塌是其發(fā)生的重要標(biāo)志之一。本研究中，忍冬藤提取物可促進(jìn)HCT116細(xì)胞線粒體膜電位坍塌。Bcl-2家族中的Bax與Bcl-2蛋白分別發(fā)揮促凋亡和抗凋亡作用，能夠調(diào)控線粒體凋亡，二者的表達(dá)變化可導(dǎo)致線粒體膜電位降低及通透性增加[14]，導(dǎo)致線粒體內(nèi)部凋亡因子如Cyt-C的釋放。Cyt-C釋放后可以與凋亡因子作用形成凋亡復(fù)合體，活化Caspase-9，進(jìn)一步活化凋亡最終執(zhí)行蛋白Caspase-3，最終啟動(dòng)線粒體凋亡途徑[5,15]。本研究中，忍冬藤提取物可劑量依賴地上調(diào)Bax/Bcl-2比值，以及Cleaved PARP、Cyt-C和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，以上提示忍冬藤提取物通過(guò)誘導(dǎo)線粒體凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

p53對(duì)細(xì)胞凋亡具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，其激活后從胞質(zhì)進(jìn)入胞核中，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡進(jìn)展。在本研究中，忍冬藤提取物可劑量依賴地上調(diào)p53蛋白表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，p53抑制劑PFT-α可逆轉(zhuǎn)忍冬藤提取物誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞凋亡，說(shuō)明忍冬藤提取物可能通過(guò)誘導(dǎo)p53依賴的線粒體凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

綜上，忍冬藤提取物可通過(guò)誘導(dǎo)p53依賴的線粒體凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，此次研究結(jié)果可為忍冬藤及其組方臨床治療結(jié)腸癌提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。