匡玉婷,胡彬雅,趙斯君,黃敏,吳雄輝,龍松良,張夢萍,鄭立春

(湖南省兒童醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長沙 410007)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)以鼻塞、流涕、打噴嚏等為常見表現(xiàn)，是由免疫球蛋白E(immunoglobulinE，IgE)所介導(dǎo)的超敏反應(yīng)性疾病，目前世界范圍內(nèi)AR發(fā)生率大約占40%，且呈逐年升高的趨勢[1-2]。盡管AR臨床表現(xiàn)癥狀較弱，對機體帶來的損傷較小，但其所帶來的負(fù)擔(dān)和成本較大，給社會經(jīng)濟和健康帶來巨大影響，且目前所使用藥物無法治愈此病，因此尋找有效治療此病的新靶點具有重要的意義[3]。隨著對AR的深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與AR的發(fā)生，研究認(rèn)為[4]miR-205-5p與鼻炎的發(fā)生密切相關(guān)，認(rèn)為其參與鼻炎發(fā)生過程中免疫炎癥反應(yīng)，但就目前而言，微小RNA-205-5p(microrna-205-5p，miR-205-5p)作為miRNA 家族中的一種，被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤患者血清中均呈高表達(dá),且與腫瘤惡性程度具有一定的相關(guān)性，但在AR中的表達(dá)研究尚未發(fā)現(xiàn)，基于此，在上述形式下，本次研究分析miR-205-5p是否經(jīng)靶向高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4(high mobility group box protein B1/Toll-like receptor 4，HMGB1/TLR4)途徑改善AR免疫功能，以明確miR-205-5p在AR中的具體作用，為臨床上此病的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 研究動物

選取6～8周齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)清潔級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量90～120 g，均購自默沙東(寧波)動物保健科技有限公司，動物許可證號：SYXK(浙)2021—0022。所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，在飼養(yǎng)過程中自由飲食、飲水。本次研究在我院倫理委員會的批準(zhǔn)下完成。

主要試劑：miR-205-5p抑制劑(antagomir)、激動劑(agomir)由廣州瑞博生物技術(shù)有限公司提供。ELISA試劑盒由上海烜雅生物科技有限公司提供。小鼠抗大鼠HMGB1、TLR4、核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)抗體均由美國Abcam公司提供。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光素酶報告試劑盒和檢測儀均由美國Promega公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 將所購買的60只大鼠隨機分為正常對照組(A組)、AR組(B組)、AR+miR-205-5p agomir組(C組)、AR+miR-205-5p antagomir組(D組)共4組，每組各15只。

A組不做任何處理，B、C、D組均采用卵清白蛋白鼻腔強化致敏建立AR模型[5]，將0.3 mg卵清白蛋白溶解于1 mL生理鹽水中，與30 mg佐劑AI(OH)3制備為混懸液，腹腔注射，隔日1次，連續(xù)注射8次。在第16天經(jīng)鼻滴入每鼻孔滴注10%卵清白蛋白溶液 20 μL(溶于 1 mL生理鹽水中)，連續(xù)7 d。末次滴入后觀察各組0.5 h內(nèi)抓鼻、打噴嚏、流涕情況，做行為學(xué)評分(表1)，若評分≥5分則表明AR建模成功，最終B、C、D組均成功建模。

表1 行為學(xué)評分

1.2.2 miR-205-5p干預(yù) 建模成功后C、D組分別尾部注射300 μg miR-205-5p agomir、miR-205-5p antagomir，A、B組注射等量生理鹽水。每周2次，1周后觀察各組大鼠變化。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 行為學(xué)評價 參照表1內(nèi)容，對4組大鼠做行為學(xué)評價。

1.3.2 免疫相關(guān)指標(biāo)測定 抽取各組0.5 mL尾靜脈血，離心取上清血清(3 000 g/min，r=5 cm)，采用ELISA法檢測免疫相關(guān)指標(biāo)：干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)及IgE水平。

1.3.3 鼻黏膜組織采集 在上述操作完成后立即處死大鼠，迅速取鼻黏膜組織，分為4份，其中2份用于病理組織學(xué)觀察，1份用于蛋白檢測，1份分離出鼻黏膜上皮細(xì)胞用于雙熒光素酶報告分析。

1.3.4 鼻黏膜炎性反應(yīng)觀察 取鼻黏膜組織，在行常規(guī)組織切片處理后做HE染色處理，顯微鏡下對各組鼻黏膜組織炎性反應(yīng)情況進行分析。

1.3.5 鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)觀察 取鼻黏膜組織，在行常規(guī)組織切片處理后醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，使用透射電鏡分別在20 000倍、15 000倍觀察鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)。

HE染色于高倍鏡(×400) 下計數(shù)5個視野EOS后取平均值。緊密連接蛋白的陽性表達(dá)以鼻黏膜及腺體-上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色、細(xì)顆粒狀為判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)的染色程度及染色細(xì)胞百分率進行分析評分:基本不著色為0分；著色淡為1分；著色適中為2分；著色深為3分。另外,每張切片400倍視野下隨機選擇不重復(fù)的5個視野,每個視野計數(shù)100個上皮細(xì)胞,計算其中著色細(xì)胞的百分率。著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率<5%為0分;5%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。將每張切片細(xì)胞著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘,總分0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強陽性(+++)。+為低表達(dá)即陰性表達(dá)，++與+++為高表達(dá)，即陽性表達(dá)。

1.3.6 緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、HMGB1/TLR4途徑蛋白測定 取鼻黏膜組織，加80 μL裂解緩沖液，將鼻黏膜組織制備為組織勻漿，12 000×g 離心15 min，離心后采集上清液，做蛋白變性、電泳處理，采用Western blot法測定Claudin-1、Occludin、HMGB1/TLR4途徑相關(guān)蛋白表達(dá)量。

1.3.7 雙熒光素酶報告實驗 經(jīng)Starbase網(wǎng)站獲得miR-205-5p、TLR4堿基結(jié)合位點，以分析miR-205-5p與TLR4的靶向關(guān)系，建立MUT-TLR4、WT-TLR4的TLR4 3’-UTR雙熒光素酶報告載體。使用LipofectamineTM2000將miR-205-5p agomir、miR-205-5p antagomir、MUT-TLR4、WT-TLR4共轉(zhuǎn)染至鼻黏膜上皮細(xì)胞，測定鼻黏膜上皮細(xì)胞熒光素酶活性，miR-205-5p與TLR4特異性結(jié)合時，熒光素酶活性降低。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 4組行為學(xué)評價

如表2所示，B組、C組、D組行為學(xué)評分高于A組(P<0.05)；C組行為學(xué)評分高于B組(P<0.05)；D組行為學(xué)評分低于B組(P<0.05)；D組行為學(xué)評分低于C組(P<0.05)。

表2 4組行為學(xué)評分對比 (分，

2.2 4組免疫相關(guān)指標(biāo)水平對比

如表3所示，B、C、D組IL-4、IgE高于A組，IFN-γ、IL-2、IL-10低于A組(P<0.05)；C組IL-4、IgE高于B組，IFN-γ、IL-2、IL-10低于B組(P<0.05)；D組IL-4、IgE低于B組，IFN-γ、IL-2、IL-10高于B組(P<0.05)；D組IL-4、IgE低于C組，IFN-γ、IL-2、IL-10高于C組(P<0.05)。

表3 4組免疫相關(guān)指標(biāo)水平對比

2.3 鼻黏膜炎性反應(yīng)觀察

A組鼻黏膜結(jié)構(gòu)完整，纖毛未脫落，未發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤；B組鼻黏膜纖毛排列較為雜亂，不規(guī)則脫落，有炎細(xì)胞浸潤；C組存在較為嚴(yán)重的纖毛脫落的癥狀，大量炎細(xì)胞浸潤；D組鼻黏膜纖毛排列恢復(fù)至整齊狀態(tài)，僅有少量纖毛脫落、炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 鼻黏膜炎性反應(yīng)觀察 (HE ×400) a:A組未發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤;b:B組有炎細(xì)胞浸潤;c:C組大量炎細(xì)胞浸潤;d:D組少量纖毛脫落、炎細(xì)胞浸潤

2.4 鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)觀察

如表4和圖2、3所示，B、C、D組緊密連接寬度高于A組，緊密連接蛋白表達(dá)量低于A組(P<0.05)；C組緊密連接寬度高于B組，緊密連接蛋白表達(dá)量低于B組(P<0.05)；D組緊密連接寬度低于B組，緊密連接蛋白表達(dá)量高于B組(P<0.05)；D組緊密連接寬度低于C組，緊密連接蛋白表達(dá)量高于C組(P<0.05)。4組鼻黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)觀察見圖4。

圖2 Western blot檢測緊密連接蛋白水平表達(dá)

圖3 鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接 (醋酸鈾+枸櫞酸鉛 ×20 000) a:A組鼻黏膜上皮細(xì)胞緊密連接呈連續(xù)的狹窄帶；b:B組緊密連接松弛，細(xì)胞間隙增大；c:C組緊密連接較為松弛，細(xì)胞間隙明顯增大；d:D組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張程度、核糖體脫落情況顯著緩解

圖4 鼻黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài) (醋酸鈾+枸櫞酸鉛 ×15 000) a:A組鼻黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)規(guī)整；b:B組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核糖體脫落；c:C組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、甚至空泡樣，核糖體脫落明顯；d:D組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張程度、核糖體脫落情況顯著緩解

表4 鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接寬度、緊密連接蛋白表達(dá)對比

2.5 4組HMGB1/TLR4途徑蛋白表達(dá)對比

如表5所示，B、C、D組HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)量高于A組(P<0.05)；C組HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)量高于B組(P<0.05)；D組HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)量低于B組(P<0.05)；D組HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)量低于C組(P<0.05)。

表5 4組HMGB1/TLR4途徑蛋白表達(dá)對比

2.6 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，WT-TLR4組miR-205-5p agomir活性顯著高于MUT-TLR4組，miR-205-5p antagomir顯著低于MUT-TLR4組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如表6所示；miR-205-5p agomir組miR-205-5p和TLR4表達(dá)量均顯著低于miR-205-5p antagomir組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如表7所示，提示miR-205-5p可與TLR4靶向結(jié)合，結(jié)合位點見圖5。

表6 各組細(xì)胞中熒光素酶活性對比

表7 各組細(xì)胞中miR-205-5p、TLR4表達(dá)對比

圖5 miR-205-5p與TLR4靶向結(jié)合位點

3 討論

miRNA屬非編碼RNA分子，由20～25個核苷酸組成，miR-205-5p屬miRNA成員之一，定位于人1號染色體q32.2位置的LOC642587基因座中的第2個內(nèi)含子，其長度大約為110個堿基[6]。有研究顯示[7-9]，miR-205-5p在人肺、乳腺、胸腺、前列腺等組織中特異性表達(dá)，能夠通過調(diào)控多種靶基因表達(dá)，與癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為有關(guān)。但隨著對miR-205-5p深入研究，發(fā)現(xiàn)其不僅參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還可促進AR發(fā)生過程中免疫炎癥級聯(lián)，在AR中表達(dá)升高，Zhang等[10]在其最新一項研究中認(rèn)為下調(diào)miR-205-5p可通過靶向BCL-2減輕變應(yīng)性鼻炎的炎癥反應(yīng)，其結(jié)果證實了miR-205-5p與AR的關(guān)系。本研究結(jié)果示，經(jīng)抑制miR-205-5p表達(dá)后的AR大鼠，AR行為學(xué)明顯改變，鼻黏膜炎性浸潤減輕，此結(jié)果證實了miR-205-5參與AR的發(fā)生。

目前關(guān)于AR發(fā)病機制研究呈現(xiàn)多方面的深入細(xì)化，大體包括鼻黏膜上皮屏障破壞、Th1/Th2失衡等[11-12]。有研究認(rèn)為[13]，在AR發(fā)生過程中，變應(yīng)原所引發(fā)的黏膜通透性明顯降低，鼻黏膜上皮屏障功能受到抑制，表現(xiàn)為鼻黏膜上皮細(xì)胞緊密連接受損，破壞緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin，其中Claudin-1作為緊密連接形成的首要骨架，兼具作為緊密連接密封件的核心作用，是Claudin家族中對屏障的結(jié)構(gòu)和功能影響最大的跨膜蛋白，Claudin-1基因缺陷會導(dǎo)致屏障功能喪失。Occludin對于屏障形成也是必須，因其具有磷酸化/去磷酸化的特性，能夠和緊密連接中蛋白質(zhì)相互作用，影響屏障功能以及物質(zhì)的跨上皮和跨內(nèi)皮運輸[14]。另外AR鼻黏膜上皮屏障功能障礙表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變，且導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、大量空泡狀，核糖體明顯脫落，間接反應(yīng)蛋白質(zhì)合成的能力下降等[15]。本文結(jié)果顯示，抑制miR-205-5p表達(dá)后AR大鼠緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin表達(dá)升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張改變恢復(fù)，提示抑制miR-205-5p表達(dá)可經(jīng)修復(fù)鼻黏膜上皮屏障損傷抑制AR進展。另外Th1/Th2失衡是導(dǎo)致AR發(fā)生進展的主要影響因素，Th1經(jīng)分泌IFN-γ、IL-2參與機體細(xì)胞免疫，Th2經(jīng)分泌IL-4、IL-10參與機體體液免疫，在AR發(fā)生進展過程中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等指標(biāo)表達(dá)紊亂，此時IgE表達(dá)異常升高，最終誘導(dǎo)AR發(fā)生過程中的免疫炎癥反應(yīng)[16-18]。本文結(jié)果顯示，抑制miR-205-5p表達(dá)可改善Th1/Th2失衡，修復(fù)鼻黏膜上皮屏障損傷，表現(xiàn)為IFN-γ、IL-2、IL-10升高、IL-4、IgE降低，鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變恢復(fù)，此結(jié)果提示miR-205-5p參與AR發(fā)生過程中Th1/Th2失衡，抑制miR-205-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡，抑制疾病進一步進展。

目前關(guān)于miR-205-5p發(fā)揮作用途徑尚未明確，有研究顯示[19-21]，HMGB1/TLR4途徑參與AR發(fā)生過程，在正常生理狀態(tài)下HMGB1定位于細(xì)胞核，但當(dāng)機體受到外界刺激后，其被大量釋放于細(xì)胞外，可經(jīng)刺激免疫系統(tǒng)分泌大量的免疫相關(guān)因子，進而導(dǎo)致免疫炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，與AR嚴(yán)重程度相關(guān)。HMGB1在AR發(fā)病過程中與TLR4特異性結(jié)合，激活下游NF-κB，而NF-κB可擾亂Th1/Th2平衡[22-24]。本文結(jié)果顯示，miR-205-5p表達(dá)被抑制后HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)量降低，提示抑制miR-205-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡的機制可能與HMGB1/TLR4活性降低有關(guān)，此結(jié)果在Zhang等研究的基礎(chǔ)上進一步驗證了miR-205-5p參與AR發(fā)生的具體途徑。且經(jīng)雙熒光素酶報告實驗分析顯示，TLR4為miR-205-5p靶基因，進一步證實了miR-205-5p經(jīng)HMGB1/TLR4途徑而發(fā)揮修復(fù)AR免疫損傷的作用。

本研究初步分析了miR-205-5p可靶向HMGB1/TLR4途徑抑制Th1/Th2失衡所引起的AR免疫障礙，但檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，并未有研究發(fā)現(xiàn)上述關(guān)系，因此，此論點尚需進一步驗證。

綜上，miR-205-5p可靶向HMGB1/TLR4途徑抑制Th1/Th2失衡所引起的AR免疫障礙，加強鼻黏膜屏障功能，從而減少變應(yīng)原的入侵，緩解AR相關(guān)癥狀，對AR的治療產(chǎn)生積極作用。