藺林，戴飛，魏瑾瑾，陳崢

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院 耳鼻咽喉頭頸外科，上海 201907)

據(jù)報(bào)道慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)在中國(guó)大陸的發(fā)病率約為8%[1]。CRS按照其外表型常分為兩型：慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和慢性鼻竇炎伴有鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)[2]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查CRSwNP發(fā)病率為1%～4%[2]。近年來(lái)隨著對(duì)鼻息肉(nasal polyps，NP)發(fā)病機(jī)制研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，歐美國(guó)家的CRSwNP患者有65%～90%表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，Eos)性炎癥[3]，而東亞國(guó)家的患者則以嗜中性粒細(xì)胞(neutrophil，Neu)性炎癥為主[4]。

CRSwNP的治療非常困難，臨床研究表明口服和局部用糖皮質(zhì)激素是有效手段[5]，但療效波動(dòng)甚大[6]?？傮w來(lái)說(shuō)，糖皮質(zhì)激素是治療Eos性NP的主要手段，但對(duì)Neu性CRSwNP的治療效果不佳，其機(jī)制尚不完全明確[7]。因此我們課題組設(shè)計(jì)了本研究，旨在評(píng)估局部用糖皮質(zhì)激素布地奈德鼻噴劑對(duì)Neu性CRSwNP的治療作用。

1 資料和方法

1.1 病例資料

本課題系嘗試性研究，研究期限為2017年7月—2018年6月，研究時(shí)間定為3個(gè)月(90 d)。正常鼻黏膜組織系從15例因鼻塞而行鼻中隔矯正和下鼻甲成形手術(shù)患者的下鼻甲黏膜中獲得，其中男7例，女8例；年齡24～64歲，平均年齡44.5歲；Neu性NP組織(經(jīng)免疫熒光染色確定)來(lái)源于15例就診于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院并行鼻內(nèi)鏡檢查的CRSwNP患者，其中男6例，女9例；年齡27～67歲，平均年齡49.7歲。所有病變組織的獲取分別在治療前就診時(shí)和治療后復(fù)診時(shí)。根據(jù)EPOS2012(European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps 2012)和中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)[2,8]對(duì)本研究中的CRSwNP患者進(jìn)行診斷，診斷流程參照本人已發(fā)表論文[9]，排除標(biāo)準(zhǔn)歸納見(jiàn)表1。該項(xiàng)研究得到復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(編號(hào)為：2016M-002)，所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

表1 病例資料 (例)

1.2 干預(yù)方法[9-11]

本項(xiàng)研究所采用藥物為布地奈德鼻噴劑，所選規(guī)格為32 μg/噴，藥液濃度為1.28 mg/mL，來(lái)自瑞典阿斯利康公司，用法為：每日2次(早醒時(shí)和晚睡前)，每次每側(cè)鼻腔2噴，每日總劑量為256 μg，干預(yù)總時(shí)間為3個(gè)月(90 d)。所獲取的標(biāo)本分為兩部分：一部分用于組織化學(xué)的分析，另一部分用于炎癥介質(zhì)的檢測(cè)。

一部分標(biāo)本用于免疫熒光染色，操作步驟按照已經(jīng)出版的文獻(xiàn)中所規(guī)定的流程進(jìn)行[9]；另一部分標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、蘇木精-伊紅染色和碘酸-雪夫染色，并進(jìn)行黏膜下腺體染色評(píng)分。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

將所獲組織塊切碎，并用RIPA裂解液分解，以髓過(guò)氧化物酶(myelopero xidase,MPO)和γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)以及黏蛋白(mucin，MUC)5AC和MUC5B相應(yīng)的ELISA試劑盒(均購(gòu)自美國(guó)MyBioSource)檢測(cè)組織中上述物質(zhì)的含量，操作流程嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。因?qū)嶒?yàn)中的數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)呈非正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法分析；如果組間Kruskal-Wallis檢驗(yàn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則用Mann-Whitney檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料特點(diǎn)

本研究所收集的Neu性CRSwNP患者中女性略多于男性，而且所有患者均為非特應(yīng)性體質(zhì)，NP組織均以I型炎癥反應(yīng)為主。研究前1個(gè)月內(nèi)也未應(yīng)用相應(yīng)藥物，本研究受外界影響較小，誤差相對(duì)較小。

2.2 不良反應(yīng)

所有患者對(duì)布地奈德鼻噴霧劑耐受性良好，其中1例鼻出血，2例鼻內(nèi)刺激感，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。

2.3 NP內(nèi)表型分析

采用免疫熒光染色方法對(duì)正常鼻黏膜組織和CRSwNP患者的NP組織進(jìn)行染色分析，結(jié)果顯示，所有正常鼻黏膜組織樣品中幾乎未出現(xiàn)Eos和Neu兩種炎癥細(xì)胞，而所有NP標(biāo)本中兩種炎癥細(xì)胞都有，但Eos數(shù)均<10個(gè)/高倍視野，而Neu數(shù)均>10個(gè)/高倍視野，因此該項(xiàng)研究中NP組織均屬于Neu性NP[12]。見(jiàn)圖1。

圖1 NP免疫熒光染色 A～D：正常鼻黏膜組織；E～H：NP組織 注：紅色熒光表示Eos染色，綠色熒光表示Neu染色，藍(lán)色熒光表示DAPI染色 (× 200)；Eos(嗜酸性粒細(xì)胞)；Neu(嗜中性粒細(xì)胞)。下同。

2.4 NP炎癥情況

采用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)正常鼻黏膜和NP組織標(biāo)本中的Neu浸潤(rùn)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP組織中Neu計(jì)數(shù)顯著多于正常鼻黏膜組織(P<0.000 1)，但用布地奈德鼻噴劑進(jìn)行局部治療后，NP組織中Neu數(shù)目并無(wú)明顯減少。隨后我們又對(duì)上述組織中的I型炎癥介質(zhì)MPO和IFN-γ進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)NP組織中兩種介質(zhì)的含量顯著升高(P均<0.000 1)，經(jīng)布地奈德鼻噴劑治療后，MPO和IFN-γ的濃度均無(wú)顯著下降。見(jiàn)圖2、3。

圖2 Neu浸潤(rùn)情況 A：正常鼻黏膜組織；B：治療前NP組織；C：治療后NP組織；D：Neu計(jì)數(shù)比較 注：陽(yáng)性染色表示Neu (×400)；****P<0.000 1。

2.5 NP黏蛋白分泌情況

采用蘇木精-伊紅染色和過(guò)碘酸-雪夫染色方法檢測(cè)正常鼻黏膜組織和NP組織中杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體分布情況。結(jié)果顯示，NP中杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著超過(guò)正常黏膜(P<0.000 1)，經(jīng)布地奈德鼻噴劑局部治療后，NP組織中該細(xì)胞數(shù)目未顯著減少；黏膜下腺體細(xì)胞情況與杯狀細(xì)胞類(lèi)似，正常鼻黏膜組織染色評(píng)分在1～3分，治療前和治療后的NP組織染色評(píng)分均在4～9分，無(wú)顯著改變(表2)。采用ELISA法對(duì)上述組織中黏蛋白MUC5AC和MUC5B進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，正常鼻黏膜組織中兩種黏蛋白含量均顯著少于NP組織(P均<0.000 1)，布地奈德噴鼻噴劑局部治療后未能減少M(fèi)UC5AC和MUC5B的含量。見(jiàn)圖4、5。

圖3 正常鼻黏膜和NP組織中MPO和IFN-γ濃度的比較 A：MPO；B：IFN-γ 注：****P<0.000 1；MPO(髓過(guò)氧化物酶)；IFN-γ(γ-干擾素)。下同。

圖4 正常鼻黏膜和NP組織中杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體細(xì)胞的情況 A：正常鼻黏膜組織中的杯狀細(xì)胞；B：NP組織中的杯狀細(xì)胞(治療前)；C：NP組織中的杯狀細(xì)胞(治療后)；D：正常鼻黏膜組織中的黏膜下腺體細(xì)胞；E：NP組織中的黏膜下腺體細(xì)胞(治療前)；F：NP組織中的黏膜下腺體細(xì)胞(治療后)；G：杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 注：A～C(蘇木精-伊紅染色 ×400)；D～F(過(guò)碘酸-雪夫染色 ×400)；****P<0.000 1。

圖5 正常鼻黏膜和NP組織中MUC 5AC和MUC5B濃度的比較 A：MUC5AC；B：MUC5B 注：****P<0.000 1；MUC(黏蛋白)。

表2 兩組組織黏膜下腺體細(xì)胞染色評(píng)分 (例)

3 討論

以前，大多數(shù)的CRSwNP相關(guān)研究均把重點(diǎn)放在歐美裔患者身上，因此許多學(xué)者都認(rèn)為NP組織中是以Eos增多為基本特征，而且對(duì)于CRSwNP伴有哮喘和/或阿司匹林不耐受的患者，其組織中Eos的浸潤(rùn)尤為顯著[13-14]；直到最近，研究CRSwNP發(fā)病機(jī)理的學(xué)者驚奇地發(fā)現(xiàn)，亞裔患者的NP是以Ⅰ型炎癥為特征，并同時(shí)伴有大量Ⅰ型炎癥因子IFN-γ的產(chǎn)生和釋放，這些研究人員經(jīng)過(guò)對(duì)患者基因組的分析鑒定，推斷其發(fā)病機(jī)制可能與基因遺傳有關(guān)[15-16]。隨后的相關(guān)研究顯示，Neu性CRSwNP并不常伴有特應(yīng)性體質(zhì)和哮喘[17-18]，但此類(lèi)型CRSwNP的治療卻比較棘手。

Neu性CRSwNP臨床上以功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)為首選治療方法，但即便是手術(shù)和保守治療聯(lián)合進(jìn)行長(zhǎng)期干預(yù)，仍有相當(dāng)一部分患者遷延不愈，這部分病癥稱(chēng)為難治性鼻竇炎[2]。另外尚有些患者不愿意接受手術(shù)或不能夠耐受手術(shù)，那就需要進(jìn)行相應(yīng)的保守治療。大量的研究顯示，局部用糖皮質(zhì)激素適合于治療Eos性NP[19]，而針對(duì)Neu性鼻腔鼻竇炎癥，相當(dāng)一部分學(xué)者建議用低劑量大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥進(jìn)行治療，其機(jī)制主要是進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[20]。針對(duì)局部用糖皮質(zhì)激素治療Neu性NP效果欠佳的機(jī)制，目前研究尚少，因此我們課題組設(shè)計(jì)本研究，旨在探討局部用糖皮質(zhì)激素布地奈德鼻噴霧劑對(duì)Neu性CRSwNP的治療作用。

本研究中，數(shù)據(jù)顯示所有NP組織中Eos數(shù)均<10個(gè)/高倍視野，而Neu數(shù)均>10個(gè)/高倍視野，而且后者呈現(xiàn)集中或散在的浸潤(rùn)，符合Neu性CRSwNP的組織表現(xiàn)[12]。我們的研究結(jié)果還表明，NP組織中Neu計(jì)數(shù)顯著多于正常鼻黏膜組織，說(shuō)明本組NP中存在典型的炎癥反應(yīng)，但用布地奈德鼻噴劑進(jìn)行局部治療后，NP組織中Neu數(shù)目無(wú)明顯減少，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素不能減少I(mǎi)型炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。為了進(jìn)一步確定組織中的炎癥反應(yīng)，我們又對(duì)正常鼻黏膜組織和NP組織中I型炎癥介質(zhì)MPO和IFN-γ進(jìn)行了分析，證實(shí)NP組織中兩種介質(zhì)的含量較正常黏膜顯著升高，而治療后MPO和IFN-γ的濃度均無(wú)顯著下降，這說(shuō)明布地奈德不能抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞的活性及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。而糖皮質(zhì)激素治療Eos性炎癥的機(jī)制之一即是該藥物可以誘導(dǎo)Eos的凋亡，從而減輕Eos型NP中的炎癥反應(yīng)[21]。

黏蛋白是一類(lèi)主要由黏多糖組成的糖蛋白，分布于呼吸道黏膜，并與呼吸道黏膜表面的水分、電解質(zhì)和抑菌物質(zhì)以及纖毛上皮共同組成黏液纖毛清除系統(tǒng)，是抵抗吸入性有害物質(zhì)的第一道防線[22]。黏蛋白表達(dá)和功能的障礙常導(dǎo)致黏液清除系統(tǒng)障礙、固有免疫失衡和氣道重構(gòu)等病變，最終誘發(fā)呼吸道的炎癥性疾病[23]；但當(dāng)此類(lèi)物質(zhì)分泌亢進(jìn)又會(huì)引發(fā)CRS發(fā)病時(shí)黏涕或黏膿涕大量的產(chǎn)生，經(jīng)前鼻孔溢出或從后鼻孔流入咽喉部，導(dǎo)致這些患者上呼吸道的不適感，甚至影響其生活質(zhì)量和生產(chǎn)勞動(dòng)[2]。研究顯示，MUC5AC主要由位于鼻黏膜上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞合成和釋放，MUC5B主要由鼻黏膜下腺體細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，MUC5AC或MUC5B在CRSwNP患者的NP中表達(dá)顯著增高，其機(jī)制可能與局部的轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[23]。

我們的研究表明，Neu性NP組織中杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著超過(guò)正常黏膜組織，說(shuō)明NP的炎癥過(guò)程伴隨著黏膜上皮杯狀細(xì)胞的增生，但經(jīng)布地奈德的局部治療，NP組織中該細(xì)胞數(shù)目未顯著減少，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素并不能有效抑制該黏液細(xì)胞的增生。黏膜下腺體細(xì)胞情況與杯狀細(xì)胞類(lèi)似，正常鼻黏膜組織染色評(píng)分在1～3分，NP治療前和治療后的染色評(píng)分均在4～9分，無(wú)顯著改變，這表明該類(lèi)藥物對(duì)此類(lèi)腺體增殖活動(dòng)的影響不佳。本研究不僅在形態(tài)學(xué)方面給予了評(píng)估，還對(duì)這些組織中黏蛋白MUC5AC和MUC5B的含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，正常組織中兩種黏蛋白含量均顯著少于NP組織，說(shuō)明NP的炎癥伴有黏液細(xì)胞分泌功能的增強(qiáng)，布地奈德噴鼻治療未能顯著減少M(fèi)UC5AC和MUC5B的含量，說(shuō)明此類(lèi)藥物對(duì)NP發(fā)病過(guò)程中杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體細(xì)胞的功能影響有限。

我們的研究還存在一定的局限性，主要表現(xiàn)在樣本數(shù)比較少，研究期限相對(duì)較短，沒(méi)有設(shè)置對(duì)照，我們將在以后的研究中給予注意。但我們初步的研究結(jié)果提示，局部用糖皮質(zhì)激素對(duì)Neu性CRSwNP無(wú)顯著治療作用。