步洪鳳顧振華張文斗李達(dá)

(1.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，湖南 長沙 410128)

前言

蠟梅(Chimonanthus praecox)，屬蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(Chimonanthus)，中國特有的落葉灌木、傳統(tǒng)名花。自然分布區(qū)大致為長江流域中下游地區(qū)，四川東部以東，湖南吉首以北，河南伏牛山以南，東到江蘇、浙江，現(xiàn)有天然群落僅存在于川東、重慶東北部、湘西北、鄂西北[1]。蠟梅高4～5m，成簇生長；葉對生，紙質(zhì)，卵狀，披針狀，頂端逐漸變鈍，全緣，有許多覆瓦狀鱗，呈黃色，呈蠟白色[2]；花期12月—次年1月，香氣濃郁；果實瘦肉多，6—7月成熟，黃似臘，香氣濃郁，是一種原產(chǎn)于我國的珍貴冬季冷香型園林植物，在我國已經(jīng)有1000多年的栽培利用歷史，廣泛應(yīng)用于我國的園林造景中[3]。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)和二代測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員開始使用分子標(biāo)記的手段對蠟梅的遺傳多樣性進(jìn)行研究。陳龍清等提取蠟梅2個自然群體內(nèi)的21個單株樣品DNA進(jìn)行RAPD分析，得出蠟梅的遺傳多樣性主要來自群體間的差異，而單株差異較小的結(jié)論，且這一結(jié)論與形態(tài)特征是一致的[4]；趙冰等對蠟梅AFLP分子標(biāo)記的反應(yīng)進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)蠟梅的DNA提取可使用改良的CTAB法，而蠟梅葉片的年齡并不影響蠟梅基因組DNA提取的使用，用MseI-EcoR I酶切組合，從168對引物中篩選出10對帶型分布均勻、多態(tài)性高且分辨能力強的引物，因而確定了適用于蠟梅AFLP反應(yīng)的最佳酶切連接、預(yù)擴和選擴體系[5]，緊接著對我國蠟梅種質(zhì)資源的7個野生自然群體進(jìn)行鑒定，設(shè)計的3對引物，共擴增出了218條多態(tài)位點，占據(jù)所有位點的86.17%，種群基因分化系數(shù)為0.2906，同樣也得出了蠟梅的遺傳多樣性主要存在于種群間，而非群體內(nèi)[6]；2008年趙冰等又使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對蠟梅種質(zhì)資源的7個野生型和2個栽培型種群的遺傳多樣性展開了進(jìn)一步的研究，使用11條引物，擴增出110條多態(tài)位點，占據(jù)了總位點的88.70%，進(jìn)一步指出了蠟梅總的遺傳多樣性水平較高，不同種群間的差異十分明顯[7]。

為了探討油菜品種內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)之間存在不同長度的多態(tài)現(xiàn)象，2001年美國加州農(nóng)學(xué)院作物系Li等根據(jù)第4代分子標(biāo)記技術(shù)開發(fā)出一種特異性克隆標(biāo)記方法，并將其命名為關(guān)聯(lián)序列擴展多態(tài)性(Sequence-Related Anplified Polymorphism，SRAP)，該方法操作簡單，結(jié)果易被重復(fù)且條帶產(chǎn)出效率中等，具有目標(biāo)片段易克隆和測序的特點[8]。在條帶的產(chǎn)出率上介于RAPD分析與AFLP分析之間，產(chǎn)率中等。引物設(shè)計可以參考AFLP的方法，通過隨機改變引物末端的堿基組成和排序獲取新的引物，然后在原有引物上添加新的SRAP標(biāo)記引物，因而不需要強調(diào)選擇引物的類型。

目前該技術(shù)在甜瓜、辣椒、棉花等的研究中均顯示出操作簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率中等、在基因組中檢測位點分布均勻等特點，并在石斛屬植物、水稻、番茄、黃瓜、油茶、杜鵑花屬植物、煙草等植物研究中得到成功應(yīng)用[9,11]，并在基因定位、圖位克隆、遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜、基因文庫圖譜、雜種優(yōu)勢預(yù)測、比較基因組等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[12]。

目前蠟梅新品種的選育主要靠播種、分株、扦插、壓條、嫁接等傳統(tǒng)的育種手段，育種周期長、勞力費時、信息量少，嚴(yán)重阻礙了蠟梅良種選育的進(jìn)程，而SRAP能較好地克服傳統(tǒng)育種的缺點，不易受環(huán)境的限制，可以大大縮短蠟梅的育種年限，提高育種效率[13]。本文目的在于提取高質(zhì)量的適于SRAP分析的蠟梅基因組DNA，并建立和優(yōu)化適于蠟梅SRAP-PCR反應(yīng)的最佳實驗體系，為這一技術(shù)在蠟梅種質(zhì)資源上的理論與應(yīng)用研究提供技術(shù)支持，從而加快鑒定、保護和合理利用我國現(xiàn)存的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2020年7月，采集常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院資源圃的蠟梅成熟葉片為試材。

1.2 主要試劑

SDS溶液、CTAB溶液、CTAB-free溶液、初提液(CHCl3∶C5H12O=24∶1)、5mol·L-1NaAc、5mol·L-1NaCl、Tris-HCl。

1.3 主要儀器

產(chǎn)自美國Applied Biosystems公司的Veriti 96-well Thermal Cycler PCR擴增儀；美國Carestream Health公司的Kodak Gel Logic 212凝膠成像系統(tǒng)；德國Hermle公司的Z323K高速冷凍型離心機；上海雙旭電子有限公司的DYY-12電泳儀、立式電泳儀；上海元析儀器有限公司的UV-2450紫外分光光度計。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA提取

DNA提取選擇CTAB溶液為主要提取試劑，具體操作流程：在碾磨時加入少許PVP-40粉末防止材料褐化，在進(jìn)行裂解前加入CTAB-free buffer洗滌蠟梅中的多糖、多酚物質(zhì)，以免影響DNA質(zhì)量。使用2%瓊脂凝膠對提取出的DNA進(jìn)行電泳檢測，然后取2μL樣液用無菌水稀釋為100μL的體系，在Eppendorf Biophotometer上測定DNA的質(zhì)量濃度(選擇OD260nm/OD280nm值選項)，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至50ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR基本體系與擴增程序

體系為30μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即150ng的模板，2.20mmol·L-1的Mg2+，1.8mmol·L-1的dNTPs，1.5mmol·L-1的引物，以及Taq酶加入量為1.8U。SRAP上游引物Me9和下游引物Em3由Invitrogen公司合成。引物序列Me9:5′-AAATTATCGATTGCAAG-3′；Em3:5′-ATGCGGTATCGATTGCAG-3′。擴增程序：在94℃進(jìn)行預(yù)變性4min；94℃ 1min、35℃復(fù)性1min、72℃延長1min 5個循環(huán)；30次重復(fù)溫度提高到55℃；72℃延長5min[9]。

1.4.3 單因子試驗

根據(jù)表1中各影響因素水平，分別研究5個因素對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響。電泳檢測后，Goldview染色，KODAK拍照檢測PCR效果。并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析與評價。

表1 SRAP-PCR反應(yīng)中的影響因素水平

2 單因子試驗結(jié)果分析

2.1 模板濃度對SRAP-PCR結(jié)果的影響

適宜的模板含量是提高擴增保真率的基礎(chǔ)。選擇合適的模板DNA濃度對于SRAP擴增至關(guān)重要，模板量過少會使PCR產(chǎn)物產(chǎn)率過低或者得不到所需條帶，但模板量過多可能會導(dǎo)致PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)非特異性條帶，同時還造成了DNA模板的浪費。在本試驗中，設(shè)計了50ng、100ng、150ng、200ng、250ng依次遞增的5個模板DNA濃度梯度。如圖1所示，5個不同濃度DNA模板反應(yīng)體系均得到了較為明顯的條帶，但高分子條帶隨著模板DNA量的增加引物二聚體的含量越來越高，同時高分子條帶隨著模板DNA濃度的增加呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，并在150ng濃度時擴增條帶最多且清晰，因此本研究認(rèn)為，150ng是該試驗體系的最佳模板含量。

圖1 模板濃度對SRAP-PCR的影響注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子量1000bp plus；編號1～5的處理編號同表1。

2.2 Mg2+濃度對SRAP-PCR結(jié)果的影響

Mg2+是Taq酶活化的主要因素，Mg2+在反應(yīng)物中的濃度對PCR的特異性及擴增效果有顯著影響。其不僅會影響到酶的活性和擴增的精確度，還會產(chǎn)生對引物與模板的結(jié)合效果差、模板與產(chǎn)物的解鏈效率低、非特異性產(chǎn)物的生成以及二聚物的生成等方面的問題。因此Mg2+的含量能對SRAP產(chǎn)物含量產(chǎn)生直接的影響，Mg2+缺乏時Taq酶的活性會下降，而且dNTP還會競爭Mg2+，dNTP的濃度會進(jìn)一步抑制Taq酶的活性。在本試驗中，Mg2+的用量選取0.7mmol·L-1、1.0mmol·L-1、1.3mmol·L-1、1.6mmol·L-1、1.9mmol·L-1、2.2mmol·L-1、2.5mmol·L-17個梯度。如圖2所示，Mg2+濃度<1.9mmol·L-1或者>2.2mmol·L-1時，擴增條帶少且不清晰。考慮到Mg2+濃度過低不利于酶的激活，Mg2+濃度太高又容易產(chǎn)生非特異條帶，因此該試驗最適Mg2+濃度為2.2mmol·L-1。

圖2 Mg2+濃度對SRAP-PCR的影響注：編號1～7的處理編號同表1；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量1000bp plus。

2.3 dNTPs濃度對SRAP-PCR結(jié)果的影響

dNTPs的含量對PCR的擴增有著直接影響作用。dNTP作為PCR的反應(yīng)底物，同時也會參與到Taq酶的Mg2+的爭奪，所以在PCR過程中，必須將dNTP調(diào)節(jié)至適宜的水平以獲得最優(yōu)的擴增結(jié)果。當(dāng)dNTPs的含量較低時，其擴增產(chǎn)物明顯降低；當(dāng)濃度太高時，誤差增大，并與Taq酶發(fā)生競爭，導(dǎo)致Mg2+含量降低，導(dǎo)致Taq酶活力降低，PCR的反應(yīng)效率下降，甚至阻礙了整個反應(yīng)過程。在本試驗中，dNTPs的用量選取0.6mmol·L-1、1.0mmol·L-1、1.4mmol·L-1、1.8mmol·L-1、2.2mmol·L-15個梯度。如圖3所示，dNTPs的5種不同濃度含量對擴增結(jié)果影響顯著，在0.6～2.2mmol·L-1，均有條帶出現(xiàn)，0.6～1.4mmol·L-1擴展條帶較1.8mmol·L-1擴增的條帶數(shù)少，清晰度也較差，同時2.2mmol·L-1擴展條帶較模糊，按照條帶豐富穩(wěn)定、清晰的原則，dNTPs適宜濃度為1.80mmol·L-1。

圖3 dNTPs濃度對SRAP-PCR的影響注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子量1000bp plus；編號1～5的處理編號同表1。

2.4 引物濃度對SRAP-PCR結(jié)果的影響

在PCR特異反應(yīng)過程中，引物起著十分關(guān)鍵的作用，高的引物濃度將導(dǎo)致不特定的突變和擴增，并能提高引物間的二聚化幾率；如果引入的引物質(zhì)量太低，與DNA的結(jié)合效率就會下降，從而導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率下降[11]。在本試驗中，引物的用量選取1.0mmol·L-1、1.5mmol·L-1、2.0mmol·L-1、2.5mmol·L-1、3.0mmol·L-15個梯度。如圖4所示，當(dāng)引物的濃度增加時，條帶亮度會出現(xiàn)變化，當(dāng)引物的密度為1.0～3.0mmol·L-1時，條帶清晰可見?；谝陨蠗l件分析，1.5mmol·L-1為最適SRAP-PCR引物濃度。

圖4 引物濃度對SRAP-PCR的影響注：編號1～5的處理編號同表1；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量1000bp plus。

2.5 Taq酶濃度對SRAP-PCR結(jié)果的影響

Taq的濃度和質(zhì)量是影響基因擴增效果的關(guān)鍵因素。過低的Taq會使放大效率下降；而在較高濃度下，PCR的穩(wěn)定性會下降，且會產(chǎn)生非特異的擴增區(qū)，從而產(chǎn)生偽陽性，即反應(yīng)體系中的亮帶并非擴增條帶。在本試驗中，Taq酶用量選取0.6U、0.8U、1.0U、1.2U、1.4U、1.6U、1.8U 7個梯度。由圖5可以看出，0.6～1.8U的Taq酶均可擴增出條帶，在1.4～1.8U時，隨著Taq酶活性單位的增加條帶亮度增加，特別以1.8U時效果最佳，故將1.8U作為最優(yōu)Taq酶用量。

圖5 Taq酶對SRAP-PCR的影響注：編號1～7的處理編號同表1；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量1000bp plus。

3 結(jié)論

本試驗采用CTAB洗滌法提取蠟梅成熟葉片的DNA能滿足SRAP-PCR擴增的要求。單因子試驗認(rèn)為，SRAP-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系為150ng的模板濃度，2.20mmol·L-1的Mg2+濃度，1.8mmol·L-1的dNTPs濃度，1.5mmol·L-1的引物濃度，1.8U的Taq酶用量。

近年來，由于植物分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，以RAPD、AFLP、SSR及ITS為代表的分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥用植物的分子鑒定和功能基因的研究。其中，RAPD技術(shù)工藝簡便，但具有穩(wěn)定性差、擴增產(chǎn)率低等缺點；AFLP技術(shù)雖具有很高的擴增產(chǎn)率，但其操作步驟繁瑣、難以實現(xiàn)自動化；SSR標(biāo)記具有中等產(chǎn)率和產(chǎn)物大多為共顯性標(biāo)記的優(yōu)點，然而該標(biāo)記既費時又昂貴；ITS序列分析在分子鑒別上的優(yōu)點突出，但其測序資金耗費大[14]。而SRAP技術(shù)則是將RAPD與AFLP技術(shù)的優(yōu)勢有機地結(jié)合起來，不僅可以解決RAPD重復(fù)率低的問題，而且可以解決AFLP技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴的問題，同時具有操作簡單、快速、低成本、可靠性好、重復(fù)性好及易于測序的特點，因而很快得到了世界范圍內(nèi)的分子生物學(xué)研究[15]。

本實驗建立了適用于蠟梅穩(wěn)定可靠、重復(fù)性強的SRAP反應(yīng)體系，但也不可避免地存在主觀因素介入而導(dǎo)致的試驗誤差，因此，建立一套更為客觀的科學(xué)評價PCR擴增結(jié)果的評價標(biāo)準(zhǔn)，將能更好地構(gòu)建PCR擴增體系。