趙永田 王興娥 趙宇 潘婷 劉莉梅

(黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000)

真菌是引發(fā)作物發(fā)生病害的主要因素之一，往往造成作物產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低，對(duì)我國(guó)糧食安全造成極大威脅[1]。自從化學(xué)農(nóng)藥面世以來(lái)，化學(xué)殺菌劑在真菌病害的防控方面發(fā)揮了重大作用，有效保障了農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。但化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用，造成了很多弊端，如抗藥菌群的出現(xiàn)，水源污染，對(duì)訪花昆蟲的毒性等[2-4]。由于化學(xué)殺菌劑凸顯出來(lái)的弊端，生物殺菌劑已成為我國(guó)近年來(lái)研發(fā)的重點(diǎn)方向。其中，植物來(lái)源的殺菌劑是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，已有大量抑菌活性成分分離并得到鑒定，部分活性成分的抑菌機(jī)制及靶標(biāo)也被發(fā)現(xiàn)，但真正被注冊(cè)為商業(yè)殺菌劑的活性成分極少。因此，很有必要梳理近20a來(lái)分離鑒定的活性成分及其抑菌機(jī)理，為植物活性成分的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 植物源抑真菌劑活性成分研究現(xiàn)狀

分離鑒定抑菌活性成分是植物源抑菌劑進(jìn)一步開發(fā)利用的基礎(chǔ)工作。截至目前，已發(fā)現(xiàn)大量的活性成分，歸納起來(lái)具有較高抑菌活性的成分主要為生物堿類、萜類、黃酮類以及精油類。

1.1 生物堿類

生物堿類天然產(chǎn)物種類重多，大多具有顯著的生物活性，尤其是在抑菌方面特別突出，是研究者們關(guān)注的重點(diǎn)。如Wei等對(duì)提取的白屈菜紅堿進(jìn)行了針對(duì)5種水稻真菌病害的抑菌檢測(cè)，結(jié)果表明，白屈菜紅堿對(duì)稻曲病菌和水稻胡麻斑病菌的EC50分別為6.53μg·mL-1和5.62μg·mL-1，而對(duì)稻曲病菌孢子的抑制在4μg·mL-1濃度可達(dá)86.7%[5]。Zhao等從菊苣的根皮中分離出2種呋喃喹啉生物堿和4種檸檬苦素衍生物，結(jié)果顯示，6種成分對(duì)黃瓜枯萎病菌均具有較好的抑制活性。多甜甜等以3種林木真菌為研究對(duì)象，檢測(cè)了馬鈴薯糖苷生物堿的生物活性，檢測(cè)表明，其對(duì)腐皮鐮刀菌抑制活性最好，EC50為0.268g·mL-1[6]。劉建新等從多裂駱駝蓬提取出生物堿類物質(zhì)，測(cè)試了對(duì)8種病原菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水溶性、脂溶性和總生物堿對(duì)4種真菌抑制效果較好，在0.5g·mL-1濃度時(shí)抑制率超過(guò)78%。邵芬娟等用酸性乙醇提取的翅果油樹生物堿，研究了對(duì)10種病原菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)在5種供試濃度下，對(duì)青霉和根霉2種菌抑制效果較好，對(duì)曲霉較差。周兵等從碎米莎草根部提取了總生物堿，檢測(cè)了對(duì)6種真菌的抑制活性，結(jié)果在400μg·mL-1濃度時(shí)，該生物堿對(duì)菌核菌、稻瘟菌、早疫菌、輪紋菌4種真菌抑制效果顯著。劉艷霞等研究了從黃皮提取的生物總堿對(duì)7種植物真菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該生物堿在10μg·mL-1濃度時(shí)對(duì)炭疽菌和枯萎菌的抑制較好，抑菌率均超過(guò)了84%。董艷芳等測(cè)定了見血青總生物堿對(duì)16種病原菌的抑菌效果，結(jié)果在240μg·mL-1濃度時(shí)該生物堿對(duì)供試的病原菌均有較高的抑制活性，進(jìn)一步測(cè)定了最低抑菌濃度(MIC)的范圍為20～160μg·mL-1。傅春燕等評(píng)價(jià)了瓜馥木總生物堿對(duì)6種植物真菌的抑制活性，結(jié)果顯示，該生物堿對(duì)6種真菌的EC50范圍為1.39～2.70g·L-1。

1.2 萜類

萜類天然產(chǎn)物在植物中廣泛存在，是具有異戊二烯結(jié)構(gòu)的衍生物，具有抗蟲、抗瘧、抑菌等生物活性。已有較多具有抑真菌活性的成分被分離和得到鑒定。如Tang等研究了青蒿素、青蒿素B、齊墩果酸等萜類物質(zhì)對(duì)4種真菌的抑制活性，結(jié)果顯示，青蒿素B對(duì)4種真菌的MIC范圍為100～150μg·mL-1。Fernández等從Hyalis argentea var.latisquama中分離到26種萜類物質(zhì)，研究表明，lindenanolides是唯一具有較強(qiáng)抑菌活性的萜類。楊婷等研究了13種萜類物質(zhì)對(duì)2種真菌的抑菌活性，試驗(yàn)表明，香芹酚抑菌效果最好，對(duì)炭疽菌和鏈格孢菌的EC50分別為40.89g·mL-1和18.19g·mL-1[7]。丁蘭等對(duì)從香茶菜屬植物中提取的4種二萜和三萜類物質(zhì)進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定，結(jié)果在400μmol·L-1濃度時(shí)，leukamenin E對(duì)蝴蝶蘭分離出的2株鐮孢菌的抑制率分別為50.5%和66.5%。魏朝霞等從大薊中分離出一種三萜類物質(zhì)3β,21β-dihydroxyl-20(30)-en-taraxastane，對(duì)枯萎菌的抑制效果較好，EC50值為1.197mg·L-1。

1.3 黃酮類

黃酮類天然產(chǎn)物是一類具有2-苯基色原酮的化合物，對(duì)植物體具有調(diào)節(jié)開花、發(fā)育等生理功能。除此之外，黃酮類在植物中還具有抑菌抗病的功能，引起學(xué)者的關(guān)注，分離出針對(duì)不同真菌具有較高活性的代謝物質(zhì)。如Salas等研究了從柑橘中提取的3種黃酮類物質(zhì)柚皮苷，橙皮苷和新橙皮苷對(duì)4種真菌的抑制活性，結(jié)果表明，所有類黃酮均顯示出抗真菌活性，但這種活性的強(qiáng)度取決于真菌的類型和所用黃酮物質(zhì)。Kanwal等從芒果中提取了5種類黃酮，并檢測(cè)了對(duì)5種真菌的抑制活性，結(jié)果顯示，5種類黃酮的所有濃度均顯著抑制了真菌的生長(zhǎng)。但不同的黃酮化合物對(duì)不同的真菌種類具有明顯的特異性。蘭健等篩選了58種植物提取物的抑菌活性，通過(guò)植物成分相關(guān)分析，表明黃酮類物質(zhì)可能是主要的抑菌活性成分。鄭津輝等研究了苦參中的黃酮類物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)對(duì)單細(xì)胞真菌效果好于絲狀真菌。程輝彩等研究發(fā)現(xiàn)，大鐮刀蘚醇提取液對(duì)立枯絲核菌的抑菌效果較好，提取液定性成分結(jié)果表明黃酮類物質(zhì)為主要抑菌物質(zhì)。

1.4 精油

2 植物源抑真菌劑的抑菌機(jī)理研究現(xiàn)狀

植物源殺菌劑進(jìn)入菌體后，會(huì)影響其物質(zhì)代謝和能量代謝過(guò)程，甚至導(dǎo)致菌體形態(tài)的改變，這些變化也是確定作用靶標(biāo)的關(guān)鍵。

2.1 對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞是菌體賴以生存的基本單元，其結(jié)構(gòu)的破壞將進(jìn)一步影響菌體的正常生理活動(dòng)。Shao等研究表明，茶樹油可以使灰霉菌的堿性磷酸酶(AKP)、OD260和電導(dǎo)率升高，脂肪酸降低，說(shuō)明茶樹油破壞了灰霉菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜通透性增加。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，百里香油可以導(dǎo)致柑橘酸腐菌的質(zhì)膜破裂和線粒體紊亂。Li等以青霉菌為指示菌，探索了大蒜油的抑菌機(jī)制，形態(tài)學(xué)觀察表明，大蒜油進(jìn)入細(xì)胞后，可以破壞青霉菌的細(xì)胞及細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的外泄。OuYang等開展了肉桂醛對(duì)曲霉菌的作用機(jī)理的研究，結(jié)果顯示，肉桂醛導(dǎo)致曲霉菌堿性磷酸酶(AKP)升高，幾丁質(zhì)含量降低，細(xì)胞壁熒光減弱等，但麥角甾醇和總脂質(zhì)含量沒有顯著變化，說(shuō)明細(xì)胞壁是肉桂醛的作用位點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞膜沒有影響[13]。Jiang等對(duì)茶多酚和茶皂素的作用機(jī)制進(jìn)行了評(píng)價(jià)，研究表明，茶多酚和茶皂素可以導(dǎo)致根霉菌胞外K+、可溶性蛋白和還原性糖的含量增多，說(shuō)明根霉菌細(xì)胞膜通透性增加。He等探索了肉桂精油對(duì)炭疽菌的可能作用機(jī)理，結(jié)果表明，肉桂精油導(dǎo)致炭疽菌細(xì)胞膜透性增加和結(jié)構(gòu)的改變[14]。Wang等評(píng)估了苦瓜種子對(duì)腐皮鐮刀菌的作用方式，電鏡觀察揭示了苦瓜種子提取物導(dǎo)致腐皮鐮刀菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性喪失。

2.2 對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝的影響

物質(zhì)代謝是菌體正常的生理活動(dòng)，很多植物殺菌劑充當(dāng)著物質(zhì)代謝的誘導(dǎo)劑或抑制劑，造成代謝過(guò)程受阻。Chen等通過(guò)蛋白質(zhì)組研究了姜黃提取物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制機(jī)理，發(fā)現(xiàn)姜黃素影響了禾谷鐮刀菌的tRNA合成和葡萄糖代謝，抑制了SDH和NADH氧化酶的活性[15]。Wang等通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)苦瓜種子提取物抑制了腐皮鐮刀菌基因組DNA的合成。劉琳等研究發(fā)現(xiàn)，芥菜乙醇提取物導(dǎo)致西瓜枯萎菌糖和蛋白質(zhì)的減少，誘導(dǎo)細(xì)胞壁相關(guān)酶幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性增高，抑制了SDH和MDH，從而抑制了菌絲的生長(zhǎng)[16]。張猛等研究認(rèn)為，百里香酚抑制了西瓜枯萎菌蛋白質(zhì)的合成以及DNA的合成。李麗萍等研究表明，紫莖澤蘭提取液導(dǎo)致青枯菌蛋白質(zhì)減少，抑制了蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)顯著抑制了POD、CAT、SDH酶的活性。

2.3 對(duì)細(xì)胞能量的影響

菌體物質(zhì)代謝的合成與分解都需要能量的參與，通過(guò)干擾能量代謝進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)也是植物源殺菌劑的常見靶標(biāo)之一。Chen等通過(guò)組學(xué)技術(shù)研究了姜黃提取物對(duì)禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制，結(jié)果表明，姜黃提取物影響了禾谷鐮刀菌的呼吸作用和能量代謝[15]。Li等研究了茶樹油對(duì)灰霉菌的作用方式，證實(shí)了茶樹油可以導(dǎo)致灰霉菌線粒體損傷和ATP酶的減少，從而導(dǎo)致ROS的積累[17]。Xin等探究了白薇生物堿對(duì)綠霉菌的抑制機(jī)理，表明安托芬生物堿抑制了綠霉菌的ATP，從而干擾了綠霉菌的能量代謝[18]。Morales等研究了對(duì)香豆酸的抑菌機(jī)制，發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸可以導(dǎo)致灰霉菌線粒體解偶聯(lián)，氧化磷酸化途徑發(fā)生改變，導(dǎo)致耗氧量增加[19]。Chen等研究表明，7-脫甲氧基娃兒藤堿除了導(dǎo)致意大利青霉菌的細(xì)胞膜透性增加外，還可以抑制TCA循環(huán)[20]。劉琳等發(fā)現(xiàn)，芥菜乙醇提取物導(dǎo)致西瓜枯萎菌呼吸代謝受到抑制，這可能是影響菌絲生長(zhǎng)的主要原因[16]。陳玉環(huán)等探究了肉桂酸和肉桂醛的抑菌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)肉桂酸和肉桂醛均可以干擾青霉菌的TCA循環(huán)，導(dǎo)致能量代謝途徑受到影響。

3 展望

雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物來(lái)源的抑真菌活性成分及其抑菌機(jī)制開展了大量研究，挖掘了大量具有殺菌活性的植物種類等，但植物源殺菌活性成分及其機(jī)理的研究與開發(fā)在以下方面還需要加強(qiáng)。

3.1 分離鑒定活性成分需要加強(qiáng)

目前仍有大量的研究停留在植物抑菌活性的初篩上，面對(duì)復(fù)雜的分離鑒定程序，很多活性物質(zhì)得不到鑒定，不利于開展仿生合成等工作。

3.2 抑菌活性成分的抑制機(jī)理需要明確

由于活性成分分離工作的復(fù)雜性，導(dǎo)致部分機(jī)理研究停留在粗提物而不是純品上，導(dǎo)致對(duì)其機(jī)理認(rèn)識(shí)的片面性。其安全性得不到客觀評(píng)估，不利于指導(dǎo)大田應(yīng)用。

3.3 注冊(cè)登記為商業(yè)化產(chǎn)品需要加快進(jìn)程

雖然大量學(xué)者報(bào)道了很多抑菌效果較好的活性成分，但只有極少量的活性成分被進(jìn)一步創(chuàng)制為商業(yè)化產(chǎn)品，這與目前我國(guó)大力加強(qiáng)生物農(nóng)藥創(chuàng)制的趨勢(shì)不符。