許曉燕，彭 珍，熊世進，肖沐巖，黃 濤，熊 濤

（南昌大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

金黃色葡萄球菌是常見的食源性病原菌之一，其產(chǎn)生的腸毒素等有害物質(zhì)會導致食物中毒，主要污染源有乳、乳制品、肉及肉制品等。金黃色葡萄球菌是僅次于沙門氏菌和副溶血弧菌的第三大致病菌，其引起的食物中毒占食源性食物中毒事件的25%左右。近年來，越來越多濫用抗生素的行為導致了病原菌耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）的出現(xiàn)，進而提高了病原菌給食品和醫(yī)藥行業(yè)所帶來的健康風險。預計到2050年，AMR每年將造成1 000萬 人的死亡。而在食品行業(yè)中常用的防腐劑主要為化學合成防腐劑，對人體健康存在一定的安全隱患。因此，綠色天然的細菌素是最具潛力的化學防腐劑的安全替代品之一。細菌素是細菌核糖體產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的蛋白類或多肽類物質(zhì)。它可以通過特異型靶點和非特異性靶點破壞細胞膜的完整性和通透性，或進入細胞內(nèi)影響DNA和蛋白質(zhì)的正常代謝等抑制或殺死病原菌，但經(jīng)人體攝入后可被胃腸道蛋白酶消化酶解，不會破壞腸道菌群的微生態(tài)平衡。

乳酸鏈球菌素是聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品法典委員會在1969年唯一認定為安全的菌素，可作為食品添加劑。但乳酸鏈球菌素只能在一定的pH值范圍內(nèi)（pH 3.5～8.0）發(fā)揮作用，并且隨著pH值和溫度的升高，其活性也會下降。因此，相對于乳酸鏈球菌素，市場上更需要活力強且使用范圍廣的新型細菌素有效遏制致病菌的滋生，以推動食品防腐劑市場的發(fā)展。目前自然發(fā)酵泡菜已經(jīng)成為分離產(chǎn)細菌素乳酸菌的重要渠道。例如，高兆建等從泡菜中篩選到1 株產(chǎn)細菌素的發(fā)酵乳桿菌，其產(chǎn)細菌素BLF52分子質(zhì)量為5.6 kDa，并且在一定的溫度和pH值范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，對金黃色葡萄球菌具有顯著抑制作用。此外，Gao Yurong等也從傳統(tǒng)發(fā)酵卷心菜中篩選到1 株格氏乳桿菌，其所產(chǎn)細菌素對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有抑制作用。但目前對分離自傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亞種所產(chǎn)細菌素的研究相對較少。本研究旨在對篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亞種所產(chǎn)細菌素進行分離鑒定，并探究其對金黃色葡萄球菌的抑菌機制，為食品級細菌素在食品行業(yè)和制藥領域中的應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指示菌金黃色葡萄球菌（）CMCC26003保藏于南昌大學國家食品科學與技術重點實驗室。

MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（2×）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色試劑盒、低分子質(zhì)量蛋白Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Applied Biosysterms公司；酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；DM300B正置熒光顯微鏡 德國徠卡公司；凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow手動純化預裝柱 武漢晶誠生物科技公司；Optima 8000 ICP-AES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國珀金埃爾默儀器有限公司；冷場發(fā)射掃描電鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選

1.3.1.1 樣品采集及乳酸菌分離

從市場上采集不同種類自然發(fā)酵的泡菜樣本22 份。從泡菜樣品中取1 mL泡菜液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，選取10、10、10三個梯度各100 μL分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基（含溴甲酚紫）上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進行連續(xù)劃線分離。隨后在培養(yǎng)基上挑取產(chǎn)黃色光暈且形態(tài)單一的菌落于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中孵育24 h，將培養(yǎng)液和50%的無菌甘油按1∶1體積比混合并保存于－80 ℃。

1.3.1.2 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的篩選

將活化好的198 株乳酸菌疑似株以2%（/）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h得到乳酸菌發(fā)酵液。將發(fā)酵液6 500×離心10 min后收集上清液，為了排除發(fā)酵液pH值對抑菌結果的影響，調(diào)節(jié)其pH 6.1±0.1并用0.22 μm微孔濾膜過濾，保存至4 ℃待用。

使用瓊脂擴散法測定不同菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性。簡言之，將培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌加入LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基中使其濃度為1.0×10CFU/mL，混勻后倒平板，待冷卻凝固后打孔（6 mm），每皿3 個孔，向每孔中加入200 μL制備好的上述分離菌株的發(fā)酵上清液，37 ℃下培養(yǎng)14～16 h，根據(jù)抑菌圈直徑大小篩選抑菌性能優(yōu)異的菌株。

1.3.1.3 產(chǎn)細菌素乳酸菌的16S rDNA鑒定

使用細菌DNA提取試劑盒對抑菌性能優(yōu)異的乳酸菌菌株進行基因組DNA的提取。以細菌通用引物27 F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用BLAST工具進行同源性比較，將測序結果導入MEGA5.2中，采用Neighbor-Joining構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 抑菌物質(zhì)性質(zhì)的初步探索

參照1.3.1.2節(jié)方法制備復篩出的抑菌優(yōu)異菌株的發(fā)酵上清液，將上清液分別在不同溫度（60、70、80、90、100 ℃水浴和121 ℃高壓蒸汽）處理30 min；不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10）處理2 h，之后調(diào)回pH 6.1；不同酶（過氧化氫酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、-糜蛋白酶）處理2 h，隨后于100 ℃滅活5 min，酶的最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。以未處理的發(fā)酵上清液作為對照。采用瓊脂擴散法測定不同處理組的抑菌活性，探究不同處理條件對乳酸乳球菌乳亞種NCU036018無菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。

1.3.3 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018生長及抑菌活性曲線

活化后的乳酸乳球菌乳亞種NCU036018按照2%（/）比例接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h，每2 h取樣一次，分別測試發(fā)酵液的OD、pH值、無細胞發(fā)酵上清液的抑菌活性（瓊脂孔擴散法）。觀察乳酸乳球菌乳亞種NCU036018在發(fā)酵過程中生長曲線、pH值和產(chǎn)細菌素的關系，確定細菌素的最適發(fā)酵時間。

1.3.4 細菌素的分離純化

1.3.4.1 硫酸銨沉淀

向制備好的乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液中緩慢添加硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度分別為20%、40%、50%、60%、70%、80%，低溫磁力攪拌過夜，4 ℃、8 000×離心15 min，棄去上清液，收集沉淀，并復溶于甲酸銨緩沖鹽溶液（0.01 mol/L、pH 3.5）中，瓊脂擴散法測定抑菌活性，確定最適的硫酸銨飽和度。

1.3.4.2 超濾

將復溶后的細菌素粗提物轉(zhuǎn)移至超濾管中，分別先后通過截留分子質(zhì)量為30、10、3 kDa的超濾管進行超濾截留（4 ℃、3 500×、25 min），收集不同的組分，采用瓊脂擴散法檢測不同組分的抑菌活性。

1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

選擇具有抑菌活性的超濾組分采用Sepharose Fast Flow瓊脂糖凝膠柱（1.5 cm×10 cm）進行層析。20 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液充分平衡后，采用不同濃度的NaCl（0～1 mol/L）進行線性梯度洗脫，流速1 mL/min。將洗脫液進行真空冷凍干燥并復溶于ddHO中，采用點種法確定具有抑菌活性的洗脫組分，以獲得較高純度的細菌素。

1.3.4.4 Tricine-SDS-PAGE分子質(zhì)量測定及凝膠原位抑菌檢測

將Marker和預處理過的細菌素樣品依次加入上樣孔中進行SDS-PAGE，兩塊凝膠同時進行。電泳完成后將其中一塊凝膠轉(zhuǎn)移至考馬斯亮藍G-250染液中染色6 h，隨后轉(zhuǎn)移至脫色液中脫色6 h。觀察樣品條帶位置并確定其分子質(zhì)量。另外一塊凝膠浸泡于洗滌液（異丙醇∶乙酸∶水=5∶2∶13），洗滌6～8 h，再用無菌水洗6 h，最后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，覆蓋上一層含有金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，觀察條帶位置是否具有抑菌活性。

1.3.5 乳球菌素036018的抑菌機制

1.3.5.1 乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

將制得的乳球菌素036018溶液用PBS以兩倍稀釋法逐步稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048 倍。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法測定抑菌活性。以肉眼觀察到產(chǎn)生抑菌圈最小的濃度為乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.5.2 乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制

參照Pei Jinjin等的方法進行金黃色葡萄球菌生物膜形成的測定。6 500×、4 ℃離心10 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌，用LB培養(yǎng)基重懸至OD為0.1，吸取100 μL重懸液至96 孔板中，加入等體積的乳球菌素036018溶液于37 ℃孵育24 h，以PBS處理的菌懸液為陰性對照。小心除去未附著的細胞，PBS洗滌3 次后甲醇固定10 min，風干后再加入200 μL 0.1%的結晶紫室溫染色30 min。用PBS洗滌3 次除去多余的結晶紫。在每孔中加入200 μL 95%乙醇溶液溶解附著的結晶紫，用酶標儀測600 nm波長處OD值，PBS為空白對照，生物膜形成率按照下式計算：

式中：OD為陰性對照組；OD為實驗組24 h后吸光度；OD為空白對照組。

1.3.5.3 K泄漏

K濃度的測定按照段改麗的方法并進行一定修改。6 500×、4 ℃離心10 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌。PBS洗滌2 次后重懸至OD為0.5，加入等體積乳球菌素036018溶液于37 ℃孵育0、0.5、1、2、3 h，PBS進行相同處理的金黃色葡萄球菌作為對照組，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測上清液中K濃度。

1.3.5.4 PI染色

采用Lu Yingying等的方法進行PI染色。6 500×、4 ℃離心10 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌，用PBS重懸菌體后，按照1∶1比例加入乳球菌素036018溶液分別處理0.5、1、2 h。之后用PBS緩沖液洗滌菌體2 次，重懸細胞并調(diào)整濃度為10CFU/mL，取95 μL細胞重懸液加入5 μL PI染色液，混勻后室溫避光孵育5～30 min，在熒光顯微鏡下觀察菌體染色情況。

1.3.5.5 掃描電子顯微鏡觀察

根據(jù)Lv Xin等的方法利用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。離心收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌菌體，PBS洗滌兩次，重懸于等體積乳球菌素036018溶液中分別處理30 min、1 h、2 h。6 500×、4 ℃離心10 min收集菌體，用PBS洗滌2 次。加入2.5%戊二醛4 ℃固定過夜。6 500×、4 ℃離心5 min收集菌體，無菌水洗滌3 次。依次使用系列體積分數(shù)梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%、100%）脫水。隨后將懸浮在100%乙醇中的菌體轉(zhuǎn)移到干凈的硅片上，室溫晾干后噴金，以PBS進行相同處理作為對照，通過冷場發(fā)射掃描電鏡觀察菌體的表面結構。

1.3.6 乳球菌素036018在牛奶中的應用

6 500×、4 ℃離心5 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌，用生理鹽水重懸并調(diào)節(jié)其濃度為2×10CFU/mL，取1 mL菌懸液加入9 mL的巴氏滅菌牛奶中。再分別加入乳球菌素036018溶液使其濃度分別為2、4、8 倍MIC。充分混勻后放于4 ℃貯藏12 h，每隔2 h取樣計活菌數(shù)。分別加入等體積PBS作為陰性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)細菌素乳酸菌鑒定

從發(fā)酵泡菜中篩選到的乳酸菌分離株D1對金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌活性，如圖1所示，該菌株在MRS固體平板上菌落形態(tài)較小，白色圓潤光滑，圓形凸起，邊緣整齊有光澤；在油鏡下呈卵圓狀，成對排列，革蘭氏染色呈陽性。

圖1 菌株D1的分離鑒定Fig. 1 Isolation and identification of strain D1

生理生化結果顯示，菌株D1過氧化氫酶陰性，能發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和甘露醇，不能利用菊糖，不能在45 ℃條件下生長，不耐4%的NaCl。

16S rDNA鑒定結果顯示（圖2），菌株D1與乳酸乳球菌乳亞種相似度達100%，結合生理生化實驗確定菌株D1為乳酸乳球菌乳亞種，并將其命名為乳酸乳球菌乳亞種NCU036018。

圖2 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain L. lactis subsp. lactis NCU036018

2.2 乳酸乳球菌NCU036018發(fā)酵上清液抑菌分析

2.2.1 pH值對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

表1 溫度、pH值、酶處理對乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Table 1 Effects of temperature, pH and enzyme treatment on the antibacterial activity of the fermentation supernatant of L. lactis subsp. lactis NCU036018

由表1可知，隨著pH值的升高，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液的抑菌活性呈現(xiàn)出顯著下降趨勢（＜0.05），但在pH 10時仍保留了70%以上的活性，說明該抑菌成分具有較好的pH值穩(wěn)定性。

2.2.2 酶處理對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

如表1所示，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液經(jīng)淀粉酶和脂肪酶處理后，抑菌活性無顯著變化（＜0.05），經(jīng)過氧化氫酶及胃蛋白酶處理后抑菌活性略有下降，經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和-糜蛋白酶處理后抑菌活性完全喪失。由此可以初步確定乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液主要抑菌成分可能是蛋白類物質(zhì)。

2.2.3 溫度發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液經(jīng)121 ℃高溫高壓處理后其抑菌活性略有下降，但仍保留了90%以上（＜0.05），50～100 ℃等不同溫度處理后抑菌活性無顯著變化。說明乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性良好，可能為耐熱的乳酸乳球菌素。

2.3 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018生長及抑菌活性曲線

圖3 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018生長曲線與抑菌活性間的關系Fig. 3 Relationship between growth curve and antibacterial activity of L. lactic subsp. lactis NCU036018

如圖3所示，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h左右進入對數(shù)期，8 h左右進入穩(wěn)定期。發(fā)酵液pH值先快速下降隨后逐漸穩(wěn)定在4.2左右。發(fā)酵上清液抑菌活性隨培養(yǎng)時間呈先上升后下降的趨勢，在14 h處達到峰值，抑菌圈直徑為13.60 mm，此時為細菌素的最佳收獲時間，這與已有研究結果相似。細菌素一般為次級代謝產(chǎn)物，通常是發(fā)酵中后期代謝產(chǎn)物，但也有文獻報道某些細菌素為初級代謝產(chǎn)物。此外，發(fā)酵后期（18～36 h）上清液的抑菌活性顯著降低，這可能與菌體釋放的一些水解酶有關。

2.4 細菌素分離純化

2.4.1 硫酸銨沉淀

如表2所示，隨著硫酸銨飽和度的上升，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液沉淀物的抑菌活性先上升后下降。在飽和度為70%時，其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性達到最強，抑菌圈直徑為13.96 mm。因此，后續(xù)選擇70%的硫酸銨進行鹽析。

表2 不同飽和度硫酸銨沉淀物的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of precipitates induced by ammonium sulfate at different concentrations

2.4.2 超濾

硫酸銨沉淀蛋白復溶物經(jīng)超濾后得到4 個組分，其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性見表3，其中截留分子質(zhì)量為10～30 kDa的組分抑菌圈最大，具有最強的抑菌活性，推測純化的目的細菌素蛋白分子質(zhì)量在10～30 kDa范圍內(nèi)。

表3 不同截留分子質(zhì)量組分的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of ultrafiltration fractions with different molecular mass cut-offs

2.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

大多數(shù)細菌素表現(xiàn)出一種陽離子結構，富含帶正電的精氨酸和賴氨酸殘基，有利于這些多肽和微生物細胞膜之間的相互作用。因此，可通過陽離子交換層析對細菌素進行純化。如圖4所示，0.2 mol/L NaCl洗脫組分具有較高的抑菌活性，說明該組分中含有目的抑菌蛋白。

圖4 不同濃度洗脫液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性Fig. 4 Antibacterial activity of the eluate at different concentrations against S. aureus

2.4.4 Tricine-SDS-PAGE

將0.2 mol/L NaCl溶液洗脫下來的組分除鹽后經(jīng)Tricine SDS-PAGE分析，觀察到泳道上出現(xiàn)較為單一的蛋白條帶，分子質(zhì)量在14.4～20 kDa范圍內(nèi)，見圖5。凝膠原位抑菌結果顯示出清晰的抑菌帶，對應于左側(cè)蛋白電泳條帶，表明純化獲得的樣品為細菌素，并將其命名為乳球菌素036018。一些研究人員從不同的菌株中純化出分子質(zhì)量各異的細菌素，如Ahmad等從sp.中分離的細菌素為51 kDa、Wayah等分離自SPW1的細菌素為1 221.074 Da、Ahn等分離自HW01的細菌素為6 kDa。而分子質(zhì)量在14.4～20 kDa范圍內(nèi)的乳酸乳球菌素鮮見報道，因此乳球菌素036018可能是一種新型細菌素。

圖5 乳球菌素036018的Tricine-SDS-PAGE和對應位置抑菌活性的檢測Fig. 5 Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of lactococcin 036018

2.5 乳球菌素036018抑菌機制分析

2.5.1 乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌的MIC

如表4所示，當乳球菌素036018稀釋倍數(shù)為128 倍時，出現(xiàn)了肉眼可見的最小抑菌圈，直徑為（7.78±0.12）mm。因此，乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌的MIC為0.50 mg/mL。

表4 不同稀釋倍數(shù)下細菌素粗提物抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of crude bacteriocin extract at different dilution ratios

2.5.2 乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

生物膜是微生物在器皿和非器皿表面形成的有結構的微生物聚集體，是食品的一個重要潛在污染源。一些致病菌在食品表面進行定植形成一層生物膜屏障外界的不利環(huán)境從而發(fā)揮致病作用。如圖6所示，與對照組相比，經(jīng)乳球菌素036018處理后，金黃色葡萄球菌生物膜的形成率降至25.51%，說明乳球菌素036018對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有較強的抑制作用，可以降低其致病能力。

圖6 乳球菌素036018處理后對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響Fig. 6 Effect of lactococcin 036018 treatment on the biofilm formation of S. aureus

2.5.3 K泄露

如圖7所示，隨著乳球菌素036018處理時間的延長，金黃色葡萄球菌細胞外K質(zhì)量濃度呈上升趨勢，且遠高于對照組水平。因此，乳球菌素036018可能破壞了金黃色葡萄球菌細胞膜的完整性導致K向胞外釋放。其他的細菌素也具有相同的報道，如抗菌肽AMP-jsa9、植物乳桿菌素GZ1-27、抗菌肽F1均通過破壞細胞膜通透性導致K泄漏。對照組在0～120 min內(nèi)胞外鉀離子水平相對穩(wěn)定在較低水平，而在120～180 min內(nèi)有較大幅度的上升，可能是因為培養(yǎng)時間過長，菌體在無營養(yǎng)條件下自身死亡從而釋放出胞內(nèi)K所導致。

圖7 乳球菌素036018及PBS處理的金黃色葡萄球菌細胞外K＋質(zhì)量濃度變化Fig. 7 Changes in extracellular potassium ion concentration in lactococcin 036018- or PBS-treated S. aureus

2.5.4 PI染色

圖8 熒光顯微鏡下金黃色葡萄球菌細胞膜的損傷情況Fig. 8 Damage of S. aureus cell membrane observed by fluorescence microscopy

PI是一種可穿透受損細胞并能與其DNA非特異性結合的活性熒光染料。PI不能透過完整細胞膜，但當細胞膜損傷時，它可進入細胞內(nèi)與DNA結合呈現(xiàn)出紅色。因此，細胞膜損傷可通過PI染色法判斷。由圖8可知，紅色的金黃色葡萄球菌的數(shù)量隨著乳球菌素036018處理時間的延長而明顯增加，而對照組則無明顯變化。結果說明乳球菌素036018處理之后金黃色葡萄球菌的細胞膜造成損傷，通透性增加，并且具有時間依賴性。

2.5.5 掃描電子顯微鏡觀察

如圖9所示，對照組的細胞結構完整飽滿，表現(xiàn)出典型的球狀、光滑的細胞膜特征。乳球菌素036018處理不同時間后，金黃色葡萄球菌細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化：0.5 h后細胞表面出現(xiàn)輕微皺縮和凹陷；處理時間延長至1 h時，細胞表面有明顯的孔洞和大范圍的皺縮；處理時間為2 h時，細胞開始表面出現(xiàn)裂紋甚至破碎，有的細胞開始發(fā)生溶解。這些結果表明，乳球菌素036018能以時間依賴性方式破壞金黃色葡萄球菌細胞膜結構甚至使其溶解。

圖9 乳球菌素036018處理后金黃色葡萄球菌細胞形態(tài)變化Fig. 9 Morphological changes of S. aureus CMCC26003 treated with lactococcin 036018 observed by scanning electron microscopy

2.6 乳球菌素036018在牛奶中防腐能力評價

圖10 乳球菌素036018在4 ℃巴氏殺菌牛奶中對金黃色葡萄球菌的抑制Fig. 10 Inhibitory effect of lactococcin 036018 on inoculated S. aureus in pasteurized milk during storage at 4 ℃

為了驗證乳球菌素036018作為食品基質(zhì)中生物防腐劑的適用性。將乳球菌素036018加入金黃色葡萄球菌污染的牛奶中觀察其防腐效果。如圖10所示，接種金黃色葡萄球菌的牛奶于4 ℃貯存12 h后，對照組菌落數(shù)略有升高，但不同濃度乳球菌素036018均在2 h內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抑制作用（＜0.05），且存在劑量依賴，隨后菌落數(shù)均趨于穩(wěn)定。其中，8MIC乳球菌素036018的處理有效降低了3 個數(shù)量級的金黃色葡萄球菌。這些數(shù)據(jù)表明，乳球菌素036018是一種有潛力的生物防腐劑，可以在運輸和保藏過程中控制乳制品中的金黃色葡萄球菌數(shù)量。

3 結 論

從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離出1 株產(chǎn)細菌素的乳酸乳球菌乳亞種NCU036018，其發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用，且對pH值、溫度穩(wěn)定，對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、-糜蛋白酶敏感，推測其抑菌成分為細菌素。通過硫酸銨沉淀、超濾、陽離子交換層析純化出細菌素乳球菌素036018，其分子質(zhì)量為14.4～20 kDa，MIC為0.50 mg/mL。乳球菌素036018能有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，可通過破壞細胞膜完整性、改變膜通透性抑制金黃色葡萄球菌。此外，乳球菌素036018在牛奶基質(zhì)中能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。綜上，細菌素乳球菌素036018具備作為生物防腐劑在食品中應用的潛力。