鄭淑娟，謝子鑫，方靖靖，王亞楠，耿睿璇，趙雨菡，李夢杰，仝 濤,2,*，黃昆侖,2,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，精準(zhǔn)營養(yǎng)與食品質(zhì)量重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品安全），食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，其特征是高血糖，主要發(fā)病原因?yàn)橐葝u素抵抗、胰島素產(chǎn)生不足或兩者兼而有之。2019年國際糖尿病聯(lián)盟報(bào)告全球糖尿病患者4.63億，占全球人口的9.3%；隨著發(fā)病率的上升，預(yù)計(jì)到2030年，全球?qū)⒂?.78億糖尿病患者。患有2型糖尿病的糖尿病患者約占所有糖尿病患者的90%。隨著被診斷出患有2型糖尿病的人數(shù)增加，患者需要更有效的藥物緩解2型糖尿病。

橄欖苦苷（oleuropein，OP）是一種棕黃色水溶性粉末，于1959年被分離出來，由羥基酪醇、橄欖酸和葡萄糖苷組成（圖1），主要存在于橄欖葉、未成熟的橄欖果和初榨橄欖油中。據(jù)報(bào)道OP具有多種生物學(xué)功能，如減肥、緩解糖尿病、改善非酒精性脂肪肝、改善糖尿病腎病、改善糖尿病心肌病和預(yù)防脫發(fā)等。

圖1 OP的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of oleuropein

在2型糖尿病的自然病程中，胰島β細(xì)胞功能隨著病程的延長而逐漸下降。隨著糖尿病的進(jìn)展，β細(xì)胞功能會逐漸惡化，胰島素生物合成和分泌會逐漸減弱，而且β細(xì)胞增殖也顯著減少，導(dǎo)致β細(xì)胞量減少。在表現(xiàn)出顯著高血糖的肥胖2型糖尿病模型/小鼠中，在糖尿病初期胰島會發(fā)生代償性肥大，但這種代償能力隨著時(shí)間延長逐漸減弱。此外，長期的糖尿病會導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病心血管并發(fā)癥、糖尿病腎病等多種并發(fā)癥出現(xiàn)。與糖尿病初期相比，病程延長的糖尿病小鼠胰島中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2和胰高血糖素樣肽-1受體的表達(dá)下調(diào)。

前期研究發(fā)現(xiàn)OP可以改善患有較長病程的/小鼠的2型糖尿病。使用年齡為17 周的/小鼠為研究對象，每日給予小鼠200 mg/kg的OP，共進(jìn)行了15 周實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示OP具有降低空腹血糖、改善葡萄糖耐量、降低胰島素抵抗指數(shù)、恢復(fù)胰臟胰島組織學(xué)特點(diǎn)、上調(diào)/小鼠肝臟Akt蛋白（蛋白激酶B）磷酸化水平的作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OP影響了/小鼠腸道微生物的多樣性和多樣性，改變了腸道微生物的組成，如增加了嗜黏蛋白阿克曼氏菌（）等微生物的相對豐度以及降低假長雙歧桿菌（）等微生物的相對豐度。OP的降血糖功效與其能改善腸道微生物群落特征有關(guān)。肝臟作為人體重要的代謝器官，對維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。在禁食期間肝臟能產(chǎn)生葡萄糖，在餐后肝臟能儲存葡萄糖。因此，除了前期研究的腸道微生物外，OP還有可能通過作用于肝臟緩解/小鼠的高血糖癥。本研究將從肝臟基因表達(dá)變化的角度探究OP改善/小鼠2型糖尿病的可能作用機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組測序可以識別經(jīng)處理后mRNA表達(dá)水平發(fā)生的變化。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序已被應(yīng)用于研究發(fā)病機(jī)制和篩選生物標(biāo)志物指標(biāo)，在糖尿病、糖尿病并發(fā)癥和神經(jīng)退行性疾病等復(fù)雜疾病的診斷和預(yù)后中發(fā)揮了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究OP對肝臟基因表達(dá)的影響，利用Ilumina NovaSeq 6000測序平臺，對小鼠的肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以鑒定OP改善/小鼠2型糖尿病的差異表達(dá)基因和富集的信號通路并推測關(guān)鍵差異表達(dá)基因，為深入研究OP改善/小鼠2型糖尿病的可能作用機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OP（分析純） 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；TRIzol、SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit試劑盒 美國Invitrogen公司；DNase I 日本TaKaRa公司；TruSeqRNA Sample Preparation Kit試劑盒美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2100生物分析儀 美國安捷倫公司；ND-2000微量分光光度計(jì) 美國Thermo公司；NovaSeq 6000測序儀美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物和方案設(shè)計(jì)

動物實(shí)驗(yàn)方案由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利和動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（批號：AW11099102-3-4）。8 周齡的BKS-em/Gpt（/）無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性小鼠和相應(yīng)年齡的野生型BKS-DB（/）SPF級雄性小鼠購買于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，并飼養(yǎng)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）動物實(shí)驗(yàn)室（SYXK（Jing）2020-0052）。動物實(shí)驗(yàn)室照明周期為12 h（每日早6∶30亮燈），房間濕度范圍為40%～70%，溫度范圍為（22±2）℃。使用普通維持飼料將動物飼喂至17 周齡。之后，將/小鼠分為兩組：/組（=7）和/＋OP組（=8）。實(shí)驗(yàn)期間，動物仍以普通維持飼料喂養(yǎng)，每籠3～4 只，自由飲水。每天對/小鼠灌胃OP（200 mg/kg） 或溶劑（水），共進(jìn)行為期15 周的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖取肝臟，裝入凍存管，液氮速凍，于－80 ℃保存。每組隨機(jī)取3 只小鼠的肝臟樣本用于轉(zhuǎn)錄組測序和基因表達(dá)分析。本研究使用的動物即Zheng Shujuan等研究中的動物。

1.3.2 RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測序

小鼠肝臟RNA的提取方法為TRIzol法。提取后使用DNase I去除基因組DNA。將得到的RNA進(jìn)行質(zhì)檢，以保證使用質(zhì)量合格的樣品進(jìn)行建庫測序。使用2100生物分析儀和ND-2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)檢，樣品合格的標(biāo)準(zhǔn)為OD/OD=1.8～2.2，OD/OD≥2.0，RNA完整值≥6.5，28S/18S≥1.0，總量＞2 μg。使用TruSeqRNA Sample Preparation Kit試劑盒建立RNA文庫。采用帶有Oligo(dT)的磁珠從1 μg總RNA中富集有poly-A尾的mRNA。利用碎片緩沖液將獲得mRNA隨機(jī)斷裂成約200 bp大小的片段。使用SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit試劑盒，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，隨后進(jìn)行第2鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈cDNA。利用End Repair Mix將雙鏈cDNA的黏性末端補(bǔ)齊為平末端后，在3’末端加上1 個(gè)A堿基，用于連接Y字形的接頭。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對cDNA進(jìn)行富集后，使用DNA Clean Beads篩選長度為200～300 bp的片段。經(jīng)TBS380（Picogreen）定量后，使用Illumina NovaSeq 6000測序平臺對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行高通量測序，測序讀長為PE150。以上過程由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）經(jīng)過去接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾篩選等流程后，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean data）。對mapped reads進(jìn)行拼接，并與參考基因組注釋信息進(jìn)行比對。本研究采用每百萬reads中來自于某轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)（transcripts per million reads，TPM）方法計(jì)算基因的表達(dá)量。再利用DEseq2軟件包篩選差異表達(dá)基因，篩選閥值為|logfold change|≥1和＜0.05。使用Goatools （https://github.com/tanghaibao/Goatools）對差異基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋。使用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）對差異表達(dá)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8進(jìn)行分析和繪圖。使用非配對雙尾檢驗(yàn)進(jìn)行比較，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及比對分析

前期的研究結(jié)果表明，OP能顯著降低/小鼠的空腹血糖（339.5 mg/dL vs 512.5 mg/dL）。OP組/小鼠的空腹血清胰島素水平（19 058.4 nIU/mL ）與對照組/小鼠的空腹血清胰島素水平（20 824.7 nIU/mL）相比盡管未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有降低的趨勢。OP不改變/小鼠血清中甘油三脂、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的水平。OP能夠改善/小鼠的葡萄糖耐受，降低胰島素抵抗指數(shù)?；贠P對/小鼠2型糖尿病的良好改善效果，為了更加深入研究OP對肝糖代謝功能的影響，利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)?組、/組和/＋OP組小鼠的肝臟進(jìn)行了分析。將轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與參考基因組進(jìn)行比對共得到530 092 506 個(gè)原始reads，經(jīng)質(zhì)控后共得到525 442 400 個(gè)clean reads。在獲得的clean reads中，所有樣品的唯一比對率均達(dá)到82%以上（表1）。值均大于97%，值均大于93%。這表明測序的數(shù)量和質(zhì)量達(dá)到了后續(xù)分析的要求。

表1 樣本測序質(zhì)量和序列比對Table 1 Sample sequencing quality and sequence mapping

2.2 差異表達(dá)基因分析

圖2展示了3 組之間的差異表達(dá)基因（＜0.05和|logFC|≥1）。野生型/組小鼠和/組小鼠之間有1 420 個(gè)基因在表達(dá)上有顯著差異。其中，與/組相比，/組中有734 個(gè)基因顯著上調(diào)，686 個(gè)基因顯著下調(diào)。/組小鼠和/＋OP組小鼠之間有539 個(gè)基因在表達(dá)上有顯著差異。其中，與/組相比，/＋OP組中有450 個(gè)基因顯著上調(diào)，89 個(gè)基因顯著下調(diào)。

圖2 差異表達(dá)基因分析Fig. 2 Differentially expressed genes

2.3 OP對肝臟基因生物學(xué)過程的影響

進(jìn)一步對OP處理組的上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋分析，并對排名前20的生物學(xué)過程進(jìn)行分析及匯總。OP處理組上調(diào)差異表達(dá)基因注釋到的前20的生物學(xué)過程中，分子功能分組主要涉及分子功能調(diào)節(jié)劑、催化活性和結(jié)合；細(xì)胞組分分組主要涉及細(xì)胞外區(qū)域部分、膜、細(xì)胞部分、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞器部分、細(xì)胞器和膜部分；生物過程分組主要涉及代謝過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞過程、發(fā)育過程、定位、對刺激的反應(yīng)、多生物過程和多細(xì)胞生物過程（圖3a）。

OP處理組下調(diào)差異表達(dá)基因注釋到的前20的生物學(xué)過程中，分子功能分組主要涉及分子功能調(diào)節(jié)劑、催化活性、結(jié)合；細(xì)胞組分分組主要涉及細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞外區(qū)域、膜、細(xì)胞部分、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞器部分、細(xì)胞器、膜部分；生物過程主要涉及代謝過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、細(xì)胞過程、發(fā)育過程、定位、對刺激的反應(yīng)、多生物過程、生物調(diào)節(jié)和多細(xì)胞生物過程（圖3b）。

圖3 OP處理后的差異表達(dá)基因的GO注釋分析Fig. 3 GO annotation analysis of differentially expressed genes after oleuropein treatment

2.4 KEGG分析

KEGG是通過分子水平信息了解生物系統(tǒng)（如細(xì)胞、組織和生態(tài)系統(tǒng)）高級功能和作用的數(shù)據(jù)庫資源。KEGG富集圖中顯示了OP上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因富集程度分別排在前20的通路，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-Akt信號通路，下調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在真核生物中核糖體的生物發(fā)生和花生四烯酸代謝途徑（圖4）。結(jié)合研究目的，以及考慮到PI3K-Akt信號通路在糖尿病血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮的重要作用，在接下來的研究中選擇PI3K-Akt信號通路進(jìn)一步探究OP改善/小鼠2型糖尿病的機(jī)制。

圖4 OP處理后上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因的KEGG信號通路富集分析Fig. 4 KEGG signaling pathway enrichment analysis of differentially expressed genes after oleuropein treatment

2.5 PI3K-Akt信號通路相關(guān)差異表達(dá)基因分析

與/組相比，OP處理后上調(diào)的差異表達(dá)基因富集在PI3K-Akt信號通路上的有、、、、、、、、、、、和等（表2）。這表明OP緩解/小鼠2型糖尿病的效果可能與調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)有關(guān)。

除了這些關(guān)鍵的差異基因表達(dá)外，又對PI3K-Akt信號通路的整個(gè)代謝途徑中差異基因可能參與的蛋白翻譯進(jìn)行了分析。在圖5中，PI3K-Akt信號通路上黃色底色框代表完成整個(gè)PI3K-Akt信號通路所參與的蛋白。差異表達(dá)基因被映射到KEGG途徑上，紅色邊框的節(jié)點(diǎn)代表差異基因顯著上調(diào)的相關(guān)蛋白表達(dá)。一個(gè)節(jié)點(diǎn)上蛋白的翻譯可能涉及多個(gè)差異表達(dá)基因。PI3K-Akt途徑是一種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，響應(yīng)細(xì)胞外信號，促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成。這一過程是通過一系列下游底物的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化介導(dǎo)，涉及的關(guān)鍵蛋白是PI3K和Akt。從圖5可以看出，在所富集到的PI3K-Akt信號通路中，OP處理后PI3K的上游蛋白受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、Toll樣受體2/4（toll-like receptor 2/4，TLR2/4）、B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）、細(xì)胞因子R、整合素（integrin alpha，ITGA）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的mRNA的表達(dá)水平都顯著上調(diào)。這些蛋白分子都對PI3K有正向調(diào)節(jié)作用。OP處理后，熱休克蛋白（heat shock protein 90，HSP90）和蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）mRNA的表達(dá)水平都顯著上調(diào)。HSP90對Akt的活性有正向調(diào)節(jié)作用，PP2A對Akt活性有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。而前期初步研究結(jié)果已經(jīng)顯示OP能夠增加/小鼠肝臟中Akt磷酸化水平。這表明HSP90的作用可能強(qiáng)于PP2A的作用。

表2 OP處理后富集在PI3K-Akt信號通路上調(diào)的差異表達(dá)基因Table 2 Up-regulated differentially expressed genes enriched in PI3K-Akt signaling pathway after oleuropein treatment

圖5 PI3K-Akt信號通路圖Fig. 5 PI3K-Akt signaling pathway

3 討論與結(jié)論

肝臟對于維持正常的葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要——它在禁食期間產(chǎn)生葡萄糖并在餐后儲存葡萄糖。然而在2型糖尿病中，發(fā)生在肝臟中的這些過程失調(diào)，這種不平衡導(dǎo)致空腹和餐后高血糖。2型糖尿病患者亞臨床肝臟胰島素抵抗會導(dǎo)致明顯的空腹高血糖。在患有2型糖尿病的個(gè)體中，在基礎(chǔ)生理?xiàng)l件下肝臟葡萄糖產(chǎn)生的比率會增加，并且在胰島素的生理水平和適度的超生理水平下，胰島素依賴性肝臟葡萄糖產(chǎn)生會受到損害。

胰島素信號傳導(dǎo)由胰島素與靶細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合觸發(fā)。胰島素與胰島素受體的亞基結(jié)合后會激活胰島素受體的亞基的酪氨酸激酶，引起亞基酪氨酸殘基磷酸化。活化的胰島素受體能招募并激活胰島素受體底物?；罨囊葝u素受體底物能激活下游信號通路，從而實(shí)現(xiàn)胰島素的生物學(xué)功能，其中PI3K-Akt途徑是胰島素發(fā)揮生物學(xué)功能重要途徑之一。胰島素抵抗涉及的關(guān)鍵分子包括PI3K和Akt。Akt是PI3K的靶蛋白，能夠促進(jìn)肝糖原生成、抑制肝糖異生。肝臟特異性敲除Akt的小鼠會表現(xiàn)出葡萄糖不耐受和胰島素抵抗的情況。已有研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食的雌性小鼠在飲用溶解于飲用水中的OP（3%）8 周后，肝臟中Akt磷酸化增加，肝臟脂肪變性得到了改善。先前的結(jié)果表明OP增加了/小鼠肝臟中蛋白Akt的磷酸化。轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果顯示OP上調(diào)的差異表達(dá)基因經(jīng)KEGG富集后主要集中在PI3KAkt信號通路。本研究根據(jù)logFC≥2的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出所富集的PI3K-Akt通路中關(guān)鍵差異表達(dá)基因?yàn)?、、、、、、、、、和?/p>

花生四烯酸的酶促反應(yīng)途徑主要涉及細(xì)胞色素P450酶4A代謝途徑、脂氧合酶5代謝途徑、環(huán)氧合酶2代謝途徑。研究表明，抑制細(xì)胞色素P450酶4A、脂氧合酶5或環(huán)氧合酶2能改善胰島素抵抗。例如，敲底/小鼠的細(xì)胞色素P450酶4A表達(dá)水平改善了/小鼠葡萄糖不耐受的情況；高脂膳食導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，選擇性抑制環(huán)氧合酶2可改善高脂膳食引起的胰島素抵抗；敲除脂氧合酶5可顯著改善小鼠的胰島素抵抗。肝臟轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，相比于/組小鼠，OP處理組肝臟中花生四烯酸代謝途徑顯著下調(diào)。這表明OP可能通過下調(diào)花生四烯酸代謝改善/小鼠2型糖尿病。

OP可顯著改善/小鼠的肝臟基因表達(dá)譜，與未經(jīng)治療的/鼠相比，OP處理組共有539 個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括450 個(gè)顯著上調(diào)基因，89 個(gè)顯著下調(diào)基因。通過對OP處理產(chǎn)生的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因發(fā)生了以PI3K-Akt信號通路激活為特征的功能轉(zhuǎn)變。OP引起了PI3K-Akt信號通路中、等27 個(gè)差異表達(dá)基因的顯著上調(diào)，其中、、、、、、、、、和可能是關(guān)鍵的差異表達(dá)基因。未來仍需要深入研究驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)的推測，以及更多的證據(jù)揭示OP通過PI3K-Akt信號通路緩解2型糖尿病的分子機(jī)制。