孫美濤，趙恒宇，李曉燕，馮琛卓，熊 偉

（1.杭州醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，浙江，杭州 310053；2.杭州醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，浙江，杭州 310053；3.大理大學基礎醫(yī)學院，云南，大理 671000）

甲狀腺癌（Thyroid Carcinoma，THCA）嚴重威脅人類健康，已成為威脅中國女性健康的第五大癌癥，并且是兒童最常見的內分泌腫瘤[1-2]。全世界約有4%的女性腫瘤病例和11%的青少年腫瘤病例為甲狀腺癌[3]。據(jù)有關報道，甲狀腺結節(jié)檢出率高達20%到76%，并且該結果已經得到了尸檢的驗證[4]。檢出甲狀腺結節(jié)的人群中，約有7%～15%的人患有甲狀腺癌[5]。目前，針對甲狀腺結節(jié)人群，臨床上多使用超聲引導下細針穿刺活檢的方法，但該方法在不同醫(yī)療機構操作方法差異較大，有較多的禁忌癥，故仍有局限性[5]。而甲狀腺癌的治療方法主要為手術治療、放射性碘治療、促甲狀腺激素抑制療法等，但上述治療方法缺乏可靠的臨床證據(jù)，仍存在一定的爭議[6-7]。因此，甲狀腺癌仍缺乏特異性強的分子標志物供臨床診斷與治療使用。目前，尋找甲狀腺癌特異分子標志和靶標是醫(yī)學研究亟待解決的問題。

細胞線粒體轉錄終止因子3（Mitochondrial transcription termination factor 3，MTERF3）是細胞內線粒體轉錄終止因子（Mitochondrial transcription termination factor，MTERF）家族成員之一，是核基因編碼并依賴高遷移蛋白轉移到線粒體的蛋白質，該基因定位于8q22.1，是結合于線粒體DNA啟動子區(qū)域的負調控因子，抑制線粒體DNA 復制、轉錄、翻譯的功能，對細胞能量代謝和氧化應激有著重要作用[8-10]。Park 等[9]的研究表明，MTERF3是胚胎發(fā)育中不可或缺的基因，敲除MTERF3 將引起小鼠胚胎死亡。MTERF3 蛋白表達異常與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展都密切相關[11]。目前該基因的異常表達與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展、預后的相關性研究報道較少。

本研究分析MTERF3 在甲狀腺癌與癌旁組織中表達差異，構建蛋白互作模型分析其生物學功能，分析其表達異常對于腫瘤免疫浸潤的影響，探究MTERF3 表達異常對于患者生存的影響，分析臨床基線資料明確其臨床意義，旨在為甲狀腺癌診療領域提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)處理

我們研究組使用TCGA 的THCA 項目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM 格式的轉錄組數(shù)據(jù)，并將FPKM 格式轉化為了TPM 格式，隨后進行了log2 轉換。同時使用UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages）處理后的TCGA 和GTEx 中TPM 的轉錄組數(shù)據(jù)，并對其進行l(wèi)og2 轉換[12]。本研究使用的R 軟件版本為3.6.3，生存分析Cutoff 設定為50%，P＜0.05被考慮為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.2 MTERF3 細胞定位及功能分析

使用Protter 數(shù)據(jù)庫以明確MTERF3 在細胞內外的定位[13]。從HPA 數(shù)據(jù)庫中下載EFO-21、HEL、U-2 OS 細胞的細胞核、微管、MTERF3 免疫熒光染色圖片，以精確MTERF3 的亞細胞定位[14-16]。使用GPS-Prot 篩選與MTERF3 相關的40 個基因以探究MTERF3 的功能，并使用R 軟件的clusterProfiler包進行富集分析[17-18]。

1.3 MTERF3 表達差異與免疫細胞浸潤的關系分析

使用R 軟件的ggplot2 對TCGA 中MTERF3 表達數(shù)據(jù)進行分析，如樣本不服從正態(tài)分布，則使用Mann-Whitney U 檢驗。同時使用ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫中收錄的Huiling He 等[19]的研究結果進行論證。

使用TIMER 在線工具分析MTERF3 表達高低對B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤程度的影響，分析MTERF3 臂刪除和臂增益變化對上述免疫細胞浸潤程度造成的影響[20-21]。

1.4 MTERF3 表達差異與生存預后、患者相關特征的關系

使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析MTERF3 表達差異對患者總生存期和無病生存期的影響[22]。用R 軟件的survival 包和surviminer 包對TCGA 數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌的臨床信息進行統(tǒng)計分析[23]。如服從正態(tài)分布，則使用卡方（x2）檢驗。

2 結果

2.1 MTERF3 在細胞內表達并參與線粒體基因表達調控

MTERF3 拓撲結構顯示其定位于胞內（如圖1A）。對免疫熒光圖片進行分析可知MTERF3 在EFO-21、HEL、U-2 OS 細胞的細胞質和線粒體中均有分布，且MTERF3 抗體的熒光不與細胞核和微管重疊（圖1E 和1B）。該基因在肺鱗癌、彌漫性大B 細胞淋巴瘤、睪丸癌等腫瘤中都存在異常表達的情況。通過對MTERF3 及其相關蛋白進行富集分析，可知其主要參與核糖體大亞基組裝及線粒體基因表達等生物過程（圖1C 和1D）。

圖1 MTERF3 的細胞定位、蛋白互作及主要功能Fig.1 Cell localization,protein interaction and main functions of MTERF3

2.2 MTERF3 在甲狀腺癌與癌旁組織中表達差異及預后意義

通過使用TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)以及ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫，Huiling He 等[19]研究也同樣表明MTERF3 轉錄組在甲狀腺癌組織中表達低于癌旁組織（P＜0.05）（如圖2A、2B、2C）。

MTERF3 在甲狀腺癌中表達與患者預后具有相關性，甲狀腺癌組織中MTERF3 低表達提示患者預后不良。腫瘤組織中MTERF3 低表達甲狀腺癌患者無病生存期（disease free survival，DFS）和無進展生存期（progression free survival，PFS）與高表達的患者的差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2D和2E），但其總生存期（overall survival，OS）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2F）。因此，甲狀腺癌組織MTERF3 低表達提示患者預后不良。

圖2 MTERF3 在甲狀腺癌中的表達差異和生存分析Fig.2 Expression difference and survival analysis of MTERF3 in Thyroid Carcinoma

2.3 MTERF3 表達差異與免疫細胞浸潤密切相關

MTERF3 表達水平與B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞浸潤水平負相關（P＜0.05）（如圖3A）。MTERF3臂刪除使B 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞浸潤水平顯著降低（P＜0.01）（圖3B）。

圖3 MTERF3 表達與免疫細胞浸潤情況相關性Fig.3 Correlation between MTERF3 expression and immune cell infiltration

2.4 MTERF3 表達與甲狀腺癌患者特征關聯(lián)性

MTERF3 的表達與T 分期（P=0.035）、年齡（P=0.025）、甲狀腺外延展情況（P=0.006）、PFS（P=0.013）明顯相關。而與N 分期、性別、甲狀腺疾病史及OS 無關（P＞0.05），如表1 所示。

表1 基線資料表Table 1 Baseline data sheet

3 討論

甲狀腺癌已成為世界上最常見的內分泌腫瘤之一，并且已成為我國發(fā)病增長率最高的內分泌惡性腫瘤[24]。根據(jù)病理組織類型分型，甲狀腺癌可分為甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、未分化型甲狀腺癌等[24]。目前，甲狀腺癌發(fā)生的分子機制尚未闡明，較多學者研究認為，促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和磷脂酰肌醇通路（PI3K-Akt signaling pathway）與甲狀腺癌的發(fā)生與進展密切相關[25-26]。有研究表明，受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）突變也與甲狀腺癌的發(fā)生密切相關，RTK 突變后可活化下游通路從而導致細胞異常增殖[25]。癌癥基因組圖譜研究網絡的學者認為，甲狀腺乳頭狀癌是一種MAPK 驅動的腫瘤，MAPK 信號通路可以促進正常的甲狀腺濾泡上皮細胞的癌化[27-28]。RAS 是一種與鳥嘌呤結合的蛋白，它的功能類似于分子開關，它在RAS-GTP 和RAS-GDP 兩種結合形式中轉化，進而調控下游PI3K-Akt 等信號通路[29-30]。RAS 突變在甲狀腺癌中較常見，在甲狀腺癌各亞型中占比可達10% ～50%，RAS 突變能夠激活PI3K-Akt 信號通路，導致該信號通路的分子異常表達，從而促進甲狀腺癌的發(fā)展[31,26]。

隨著現(xiàn)代分子測序技術的發(fā)展，非編碼RNA在甲狀腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用也逐漸受到學界重視。李勇等[32]認為小RNA（MicroRNA，miRNA）在甲狀腺癌患者的體液和外泌體中存在表達差異，在甲狀腺癌發(fā)生、轉移和耐藥等過程中發(fā)揮重要作用。朱楚夢等[33]學者認為，長鏈非編碼RNA（LncRNA）也在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。LncRNA 能夠調節(jié)自噬、凋亡、PI3K-Akt等信號通路[33]。LncRNA 可以作為miRNA 的前體分子調節(jié)miRNA 的表達，調控編碼基因的啟動子影響基因表達，能與特定蛋白結合從而調節(jié)蛋白活性[33]。劉長路等[34]研究表明，攝碘不足、電離輻射、激素和遺傳等因素與甲狀腺癌的發(fā)生相關。雖然甲狀腺癌病死率低，但其發(fā)病率極高，并且在女性中的發(fā)病率高于男性[35]。在體檢觸診中，甲狀腺結節(jié)的檢出率極高，引起人們的高度關注[4,36]。近年來，多種新型檢查技術的運用顯著提高了甲狀腺癌的確診率，但有創(chuàng)的檢查存在禁忌癥和潛在的不良反應，從而對患者造成負面影響。有研究報道，使用蛋白組學數(shù)據(jù)尋找甲狀腺癌的核心蛋白，對甲狀腺癌的確診有較高的預測效率[37]。此外，放化療對甲狀腺癌患者療效較差[38]。因此，明確甲狀腺癌的分子診斷標記和尋找靶向藥物治療是亟待解決的問題。在醫(yī)學臨床上，對甲狀腺癌患者多采用手術治療，并聯(lián)合放射性碘治療[39]。但隨著臨床技術的提高，熱消融、免疫治療和分子靶向治療也成為了輔助治療甲狀腺癌患者的手段[39-41]。

MTERF 是一個比較保守的蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)該家族由4 個成員組成（MTERF1～MTERF4），存在于動、植物的細胞中，定位于植物的葉綠體和動、植物的線粒體，與線粒體DNA 結合，從而影響線粒體的功能[11,42]。該家族成員調控線粒體DNA轉錄，介導線粒體RNA 甲基轉移酶（NOP2/Sun RNA methyltransferase 4，NSUN4）靶向線粒體核糖體大亞基，從而在調節(jié)線粒體基因的翻譯中發(fā)揮重要作用[43-46]。MTERF3 是MTERF 蛋白家族的重要成員，結合于線粒體DNA 轉錄起始區(qū)域，抑制線粒體DNA 的轉錄，從而抑制細胞能量的產生[11]。據(jù)相關研究報道，MTERF3 在線粒體DNA 的轉錄中起到負調控的作用，該基因與線粒體DNA 的啟動子區(qū)域相結合，對線粒體DNA 的基因表達發(fā)揮其抑制作用[9]。

有諸多學者研究表明，該基因對腫瘤、線粒體相關疾病、神經退行性疾病的診療有潛在的價值[47-48]。該基因在胃癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、大腸腺癌、肝細胞癌、腦膠質瘤等多種腫瘤組織中表達水平顯著高于正常組織[49-55]。有研究報道，MTERF3 在結直腸癌細胞中上調白介素6 和白介素11，從而促進結直腸癌的進展[56]。原因可能是MTERF3高表達抑制了線粒體DNA 的復制和轉錄，造成線粒體呼吸酶活性降低，從而細胞內ATP 合成減少[11,52]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)MTERF3 在甲狀腺癌中的表達顯著低于正常甲狀腺組織，與胃癌、肺癌、子宮頸癌等腫瘤組織的表達情況不同。因此，后續(xù)研究應注重闡明該基因在甲狀腺癌中異常表達的原因。

本研究分析多組學數(shù)據(jù)可知，MTERF3 定位于線粒體，與線粒體和核糖體的結構和功能密切相關，它通過影響線粒體基因轉錄、線粒體核糖體大亞基裝配從而對線粒體基因表達產生影響；該基因在甲狀腺癌組織中表達顯著低于癌旁組織；該基因低表達的患者無進展生存期更短，提示患者預后較差；該基因低表達有著較高的免疫細胞浸潤水平；該基因表達情況與患者的疾病分期、甲狀腺是否外延伸及患者的預后有一定的相關性。

本研究針對MTERF3 在甲狀腺癌中的表達及預后情況進行了相對全面的生物信息學分析。學術界普遍認為，甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展并不是由單一的基因起決定性作用，目前已有研究者對甲狀腺癌相關的基因集通路進行分析，以期待為甲狀腺癌診斷、預后、靶向治療提供可靠的生物標記物[42,57]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MTERF3 低表達的甲狀腺癌患者的預后較差。也有研究報道，MTERF3 表達降低會促進線粒體DNA 轉錄，并阻礙線粒體中核糖體大亞基的組裝[11,58]。因此，MTERF3 在甲狀腺癌患者中表達較低的原因可能為，MTERF3 低表達的患者有較少數(shù)量的MTERF3 與線粒體DNA 轉錄起始區(qū)域結合，從而對線粒體DNA 的負性調控作用較弱，線粒體DNA 的基因表達增加，同時影響線粒體中核糖體的功能，促進ATP 合成，使得MTERF3 低表達的患者腫瘤細胞能量代謝更為旺盛，有利于甲狀腺癌細胞的增殖[11,55,58]。盡管本研究通過多組學數(shù)據(jù)和臨床基線資料初步得出MTERF3 低表達與甲狀腺癌進展有關聯(lián)的結論，但仍缺乏實驗驗證來明確其具體的機制。在后續(xù)研究中，我們將使用小干擾RNA 在甲狀腺癌細胞內構建MTERF3 基因沉默模型，明確MTERF3 低表達對甲狀腺癌細胞增殖的影響，探究MTERF3 低表達對于甲狀腺癌細胞能量代謝和線粒體功能的影響及相關機制，從而為甲狀腺癌診療領域提供理論參考。