劉靜

中國食品藥品檢定研究院

肖妍

中國食品藥品檢定研究院

于健東*

中國食品藥品檢定研究院

戴忠

中國食品藥品檢定研究院

馬雙成*

中國食品藥品檢定研究院

牛黃消炎片處方由人工牛黃、珍珠母、蟾酥、青黛、天花粉、大黃和雄黃七味藥材組成，具有清熱解毒，消腫止痛的功效[1-2]。處方中大黃為常用中藥，自《中國藥典》1953年版首次收載后，后續(xù)歷版《中國藥典》中均有收載，其來源為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖，秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖，除去細(xì)根，刮去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃的功效。用于實(shí)熱積滯便秘，血熱吐衄，目赤咽腫，癰腫疔瘡，腸癰腹痛，瘀血經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻，跌打損傷，濕熱痢疾，黃疸尿赤，淋證，水腫；外治燒燙傷[3-4]。統(tǒng)計(jì)表明，《中國藥典》2020年版一部收載的中成藥處方中涉及大黃及其炮制品的品種有160 余種，由此可見，大黃藥材應(yīng)用廣泛。作為用藥歷史悠久的常用中藥材，近年來隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，大黃藥材市場需求量不斷增加，但由于藥材資源相對(duì)有限，導(dǎo)致目前市場上的商品大黃中?；煊型瑢佼惙N植物的根冒充大黃藥用的現(xiàn)象，以華北大黃、河套大黃等非正品大黃較為常見。研究表明，與正品大黃所含番瀉苷類成份不同的是，這些摻偽混用的大黃所含特征性成份為二苯乙烯苷類化合物，又以土大黃苷為代表性成份[5-9]。隨著藥品監(jiān)管力度的不斷加大[10]，國家藥品監(jiān)督管理局已批復(fù)了大黃補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目（批準(zhǔn)件編號(hào)：2010001），并陸續(xù)頒布了增加土大黃苷檢查項(xiàng)的中成藥藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，如三黃片、牛黃解毒片、炎可寧片等，有效控制了相關(guān)品種的大黃摻偽問題。在此基礎(chǔ)上，《中國藥典》自2015年版一部起，大黃檢查項(xiàng)中土大黃苷的檢查方法修訂為更為靈敏準(zhǔn)確的薄層色譜法（TLC）。此外，多個(gè)含大黃中成藥品種分別研究建立了土大黃苷的檢查方法，主要以薄層色譜法和高效液相色譜法（HPLC）為主[11-16]。

本文研究建立了牛黃消炎片中土大黃苷的系列檢測方法，包括采用 TLC 法對(duì)牛黃消炎片中土大黃苷進(jìn)行快速篩查，并進(jìn)一步采用 HPLC 和HPLC-MS/MS 法進(jìn)行驗(yàn)證，以充分保障檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果顯示，來自14 家生產(chǎn)企業(yè)的60 批樣品經(jīng) TLC 快速篩查有17 批樣品中檢出土大黃苷成份，并進(jìn)一步經(jīng)HPLC 和HPLC-MS/MS 法對(duì)保留時(shí)間、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜裂解行為等相關(guān)信息進(jìn)行了確證，表明牛黃消炎片個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)存在大黃摻偽混用的情況，該系列檢測方法為藥品監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

CAMAG自動(dòng)點(diǎn)樣儀、CAMAG-Reprostar 3 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；Waters2695 高效液相色譜系統(tǒng)（包括Waters 2695 液相色譜儀、Waters2996 DAD 紫外檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器及EMPOWER 2 工作站）（美國沃特世公司）；Agilent 1200-6320 Ion trap 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；Millipore 濾水機(jī)（美國密理博公司）；AE240 型電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

土大黃苷對(duì)照品（ 批號(hào)110794-201105）、人工牛黃對(duì)照藥材（批號(hào)121197-201204）、珍珠母對(duì)照藥材（批號(hào)121500-200501）、蟾酥對(duì)照藥材（批號(hào)121132-200803）、青黛對(duì)照藥材（批號(hào)121170-201102）和天花粉對(duì)照藥材（批號(hào)121361-201202）均來自中國食品藥品檢定研究院；雄黃購于北京同仁堂股份有限公司；牛黃消炎片樣品來自14 家生產(chǎn)企業(yè)A～N，共60 批，樣品情況詳見表1；甲苯、甲酸乙酯、丙酮、甲酸和甲醇均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；乙腈和甲醇為色譜純（美國Thermo Fisher 公司）。

表1 牛黃消炎片樣品基本信息

續(xù)表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

精密稱取土大黃苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml 含0.1mg、0.08mg 的溶液，分別作為TLC、HPLC 檢查用對(duì)照品溶液。

分別取人工牛黃、蟾酥、天花粉、雄黃、珍珠母和青黛對(duì)照藥材適量，按處方制得缺大黃陰性對(duì)照樣品，取適量，加甲醇5ml，超聲（功率：300W，頻率：40kHz）30min，0.45μm 微 孔濾膜濾過，得到陰性對(duì)照溶液。

2.1.2 供試品溶液

取牛黃消炎片10 片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇5ml，超聲（功率：300W，頻率：40kHz）30min，0.45μm 微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。

2.2 TLC 法檢查

2.2.1 色譜條件

薄層板：聚酰胺薄膜；展開劑：甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲酸-甲醇（30: 5: 5: 0.1: 20）；檢視：紫外 UV 366nm 下檢視；點(diǎn)樣量：5μl。

2.2.2 結(jié)果

取TLC 檢查用對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液和供試品溶液各5μl，分別點(diǎn)樣于聚酰胺薄膜上，參照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)。按2.2.1 檢視條件檢視，結(jié)果60批測試樣品中有17 批在與土大黃苷對(duì)照品Rf值一致的位置有相同顏色的熒光斑點(diǎn)檢出。部分樣品TLC 結(jié)果，如圖1所示。

圖1 牛黃消炎片樣品、對(duì)照品與陰性對(duì)照TLC 色譜圖（UV 366 nm）

2.3 HPLC 法驗(yàn)證

2.3.1 色譜條件

色譜柱：PrevailTMC18 （250mm×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（30: 7: 63）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：320nm；進(jìn)樣量：10μl。理論塔板數(shù)按土大黃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.3.2 檢測限

取HPLC 檢查用對(duì)照品溶液，加甲醇逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測定，取信噪比（S/N）為3 ∶1時(shí)的濃度為檢出限，結(jié)果為0.008μg/ml。

2.3.3 結(jié)果

取TLC 檢查陽性供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液在與土大黃苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的位置均有色譜峰檢出，同時(shí)提取該色譜峰的光譜圖，結(jié)果顯示在280～400nm 波長范圍的吸收光譜與土大黃苷對(duì)照品一致。代表性樣品HPLC 色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 代表性樣品、對(duì)照品與陰性對(duì)照HPLC 色譜圖

圖3 紫外吸收光譜圖

2.4 HPLC-MS/MS 法確證

2.4.1 色譜條件

同HPLC 法 2.3.1 項(xiàng)下。

2.4.2 質(zhì)譜檢測參數(shù)

電噴霧（ESI）離子化源；電離模式：負(fù)離子模式，全掃描模式；離子掃描范圍：m/z100～500；霧化氣：25psi；干燥氣：12L/min；干燥溫度：320℃；分流比：1: 9。

2.4.3 結(jié)果

在上述色譜與質(zhì)譜條件下，土大黃苷對(duì)照品的準(zhǔn)分子離子峰m/z419 [M-H]-，保留時(shí)間為19.4min；對(duì)該分子離子峰m/z419 [M-H]-進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z257 [M-H-162]-，為丟失 葡萄糖基產(chǎn)生的碎片離子。17 批陽性樣品經(jīng)HPLC-MS/MS 分析，結(jié)果與土大黃苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰均能檢測到m/z419 [M-H]-，即土大黃苷的準(zhǔn)分子離子峰，進(jìn)一步對(duì)m/z419 [M-H]-進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，則均產(chǎn)生與對(duì)照品一致的碎片離子峰，相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖4 土大黃苷的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.5 樣品測定結(jié)果

綜合上述薄層色譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次抽檢的14 家生產(chǎn)企業(yè)60 批樣品中，有17 批檢出土大黃苷，涉及4 家生產(chǎn)企業(yè)，具體結(jié)果詳見表2。

表2 牛黃消炎片中檢出土大黃苷成份結(jié)果情況

續(xù)表

3 討論

牛黃消炎片中土大黃苷檢查結(jié)果反映了處方中涉及的大黃藥味存在一定程度的摻偽混用問題。本研究充分結(jié)合摻偽大黃中代表性成份土大黃苷的二苯乙烯苷結(jié)構(gòu)特征，選取對(duì)此類成份具有良好分離效果的聚酰胺薄膜作為薄層板，利用其熒光特性進(jìn)行檢視，能夠較好地排除干擾。此外，鑒于牛黃消炎片處方藥味多，所含化學(xué)成份復(fù)雜等特點(diǎn)，本研究進(jìn)一步建立了HPLC 和HPLCMS/MS 驗(yàn)證方法，能夠進(jìn)一步對(duì)保留時(shí)間、紫外吸收光譜、二級(jí)質(zhì)譜測定等多方面信息進(jìn)行綜合比對(duì)分析。上述系列檢查方法適用于大量樣品的快速篩查，能夠保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，為藥品質(zhì)量監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，對(duì)保障人民群眾用藥安全與有效具有重要意義。