劉靜

中國食品藥品檢定研究院

肖妍

中國食品藥品檢定研究院

于健東*

中國食品藥品檢定研究院

戴忠

中國食品藥品檢定研究院

馬雙成*

中國食品藥品檢定研究院

牛黃消炎片處方由人工牛黃、珍珠母、蟾酥、青黛、天花粉、大黃和雄黃七味藥材組成，具有清熱解毒，消腫止痛的功效[1-2]。處方中大黃為常用中藥，自《中國藥典》1953年版首次收載后，后續(xù)歷版《中國藥典》中均有收載，其來源為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖，秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖，除去細(xì)根，刮去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃的功效。用于實熱積滯便秘，血熱吐衄，目赤咽腫，癰腫疔瘡，腸癰腹痛，瘀血經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻，跌打損傷，濕熱痢疾，黃疸尿赤，淋證，水腫；外治燒燙傷[3-4]。統(tǒng)計表明，《中國藥典》2020年版一部收載的中成藥處方中涉及大黃及其炮制品的品種有160 余種，由此可見，大黃藥材應(yīng)用廣泛。作為用藥歷史悠久的常用中藥材，近年來隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，大黃藥材市場需求量不斷增加，但由于藥材資源相對有限，導(dǎo)致目前市場上的商品大黃中?；煊型瑢佼惙N植物的根冒充大黃藥用的現(xiàn)象，以華北大黃、河套大黃等非正品大黃較為常見。研究表明，與正品大黃所含番瀉苷類成份不同的是，這些摻偽混用的大黃所含特征性成份為二苯乙烯苷類化合物，又以土大黃苷為代表性成份[5-9]。隨著藥品監(jiān)管力度的不斷加大[10]，國家藥品監(jiān)督管理局已批復(fù)了大黃補(bǔ)充檢驗方法和檢驗項目（批準(zhǔn)件編號：2010001），并陸續(xù)頒布了增加土大黃苷檢查項的中成藥藥品補(bǔ)充檢驗方法，如三黃片、牛黃解毒片、炎可寧片等，有效控制了相關(guān)品種的大黃摻偽問題。在此基礎(chǔ)上，《中國藥典》自2015年版一部起，大黃檢查項中土大黃苷的檢查方法修訂為更為靈敏準(zhǔn)確的薄層色譜法（TLC）。此外，多個含大黃中成藥品種分別研究建立了土大黃苷的檢查方法，主要以薄層色譜法和高效液相色譜法（HPLC）為主[11-16]。

本文研究建立了牛黃消炎片中土大黃苷的系列檢測方法，包括采用 TLC 法對牛黃消炎片中土大黃苷進(jìn)行快速篩查，并進(jìn)一步采用 HPLC 和HPLC-MS/MS 法進(jìn)行驗證，以充分保障檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果顯示，來自14 家生產(chǎn)企業(yè)的60 批樣品經(jīng) TLC 快速篩查有17 批樣品中檢出土大黃苷成份，并進(jìn)一步經(jīng)HPLC 和HPLC-MS/MS 法對保留時間、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜裂解行為等相關(guān)信息進(jìn)行了確證，表明牛黃消炎片個別生產(chǎn)企業(yè)存在大黃摻偽混用的情況，該系列檢測方法為藥品監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

CAMAG自動點樣儀、CAMAG-Reprostar 3 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；Waters2695 高效液相色譜系統(tǒng)（包括Waters 2695 液相色譜儀、Waters2996 DAD 紫外檢測器、自動進(jìn)樣器及EMPOWER 2 工作站）（美國沃特世公司）；Agilent 1200-6320 Ion trap 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；Millipore 濾水機(jī)（美國密理博公司）；AE240 型電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

土大黃苷對照品（ 批號110794-201105）、人工牛黃對照藥材（批號121197-201204）、珍珠母對照藥材（批號121500-200501）、蟾酥對照藥材（批號121132-200803）、青黛對照藥材（批號121170-201102）和天花粉對照藥材（批號121361-201202）均來自中國食品藥品檢定研究院；雄黃購于北京同仁堂股份有限公司；牛黃消炎片樣品來自14 家生產(chǎn)企業(yè)A～N，共60 批，樣品情況詳見表1；甲苯、甲酸乙酯、丙酮、甲酸和甲醇均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；乙腈和甲醇為色譜純（美國Thermo Fisher 公司）。

表1 牛黃消炎片樣品基本信息

續(xù)表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

精密稱取土大黃苷對照品適量，加甲醇制成每1ml 含0.1mg、0.08mg 的溶液，分別作為TLC、HPLC 檢查用對照品溶液。

分別取人工牛黃、蟾酥、天花粉、雄黃、珍珠母和青黛對照藥材適量，按處方制得缺大黃陰性對照樣品，取適量，加甲醇5ml，超聲（功率：300W，頻率：40kHz）30min，0.45μm 微 孔濾膜濾過，得到陰性對照溶液。

2.1.2 供試品溶液

取牛黃消炎片10 片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇5ml，超聲（功率：300W，頻率：40kHz）30min，0.45μm 微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。

2.2 TLC 法檢查

2.2.1 色譜條件

薄層板：聚酰胺薄膜；展開劑：甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲酸-甲醇（30: 5: 5: 0.1: 20）；檢視：紫外 UV 366nm 下檢視；點樣量：5μl。

2.2.2 結(jié)果

取TLC 檢查用對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各5μl，分別點樣于聚酰胺薄膜上，參照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗。按2.2.1 檢視條件檢視，結(jié)果60批測試樣品中有17 批在與土大黃苷對照品Rf值一致的位置有相同顏色的熒光斑點檢出。部分樣品TLC 結(jié)果，如圖1所示。

圖1 牛黃消炎片樣品、對照品與陰性對照TLC 色譜圖（UV 366 nm）

2.3 HPLC 法驗證

2.3.1 色譜條件

色譜柱：PrevailTMC18 （250mm×4.6mm,5μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（30: 7: 63）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：320nm；進(jìn)樣量：10μl。理論塔板數(shù)按土大黃苷峰計算應(yīng)不低于2500。

2.3.2 檢測限

取HPLC 檢查用對照品溶液，加甲醇逐級稀釋后進(jìn)行測定，取信噪比（S/N）為3 ∶1時的濃度為檢出限，結(jié)果為0.008μg/ml。

2.3.3 結(jié)果

取TLC 檢查陽性供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液在與土大黃苷對照品保留時間一致的位置均有色譜峰檢出，同時提取該色譜峰的光譜圖，結(jié)果顯示在280～400nm 波長范圍的吸收光譜與土大黃苷對照品一致。代表性樣品HPLC 色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 代表性樣品、對照品與陰性對照HPLC 色譜圖

圖3 紫外吸收光譜圖

2.4 HPLC-MS/MS 法確證

2.4.1 色譜條件

同HPLC 法 2.3.1 項下。

2.4.2 質(zhì)譜檢測參數(shù)

電噴霧（ESI）離子化源；電離模式：負(fù)離子模式，全掃描模式；離子掃描范圍：m/z100～500；霧化氣：25psi；干燥氣：12L/min；干燥溫度：320℃；分流比：1: 9。

2.4.3 結(jié)果

在上述色譜與質(zhì)譜條件下，土大黃苷對照品的準(zhǔn)分子離子峰m/z419 [M-H]-，保留時間為19.4min；對該分子離子峰m/z419 [M-H]-進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z257 [M-H-162]-，為丟失 葡萄糖基產(chǎn)生的碎片離子。17 批陽性樣品經(jīng)HPLC-MS/MS 分析，結(jié)果與土大黃苷對照品保留時間一致的色譜峰均能檢測到m/z419 [M-H]-，即土大黃苷的準(zhǔn)分子離子峰，進(jìn)一步對m/z419 [M-H]-進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，則均產(chǎn)生與對照品一致的碎片離子峰，相應(yīng)的二級質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖4 土大黃苷的二級質(zhì)譜圖

2.5 樣品測定結(jié)果

綜合上述薄層色譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用驗證實驗結(jié)果，本次抽檢的14 家生產(chǎn)企業(yè)60 批樣品中，有17 批檢出土大黃苷，涉及4 家生產(chǎn)企業(yè)，具體結(jié)果詳見表2。

表2 牛黃消炎片中檢出土大黃苷成份結(jié)果情況

續(xù)表

3 討論

牛黃消炎片中土大黃苷檢查結(jié)果反映了處方中涉及的大黃藥味存在一定程度的摻偽混用問題。本研究充分結(jié)合摻偽大黃中代表性成份土大黃苷的二苯乙烯苷結(jié)構(gòu)特征，選取對此類成份具有良好分離效果的聚酰胺薄膜作為薄層板，利用其熒光特性進(jìn)行檢視，能夠較好地排除干擾。此外，鑒于牛黃消炎片處方藥味多，所含化學(xué)成份復(fù)雜等特點，本研究進(jìn)一步建立了HPLC 和HPLCMS/MS 驗證方法，能夠進(jìn)一步對保留時間、紫外吸收光譜、二級質(zhì)譜測定等多方面信息進(jìn)行綜合比對分析。上述系列檢查方法適用于大量樣品的快速篩查，能夠保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，為藥品質(zhì)量監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，對保障人民群眾用藥安全與有效具有重要意義。