劉靜
中國食品藥品檢定研究院
肖妍
中國食品藥品檢定研究院
于健東*
中國食品藥品檢定研究院
戴忠
中國食品藥品檢定研究院
馬雙成*
中國食品藥品檢定研究院
牛黃消炎片處方由人工牛黃、珍珠母、蟾酥、青黛、天花粉、大黃和雄黃七味藥材組成,具有清熱解毒,消腫止痛的功效[1-2]。處方中大黃為常用中藥,自《中國藥典》1953年版首次收載后,后續(xù)歷版《中國藥典》中均有收載,其來源為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖,秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖,除去細(xì)根,刮去外皮,切瓣或段,繩穿成串干燥或直接干燥。具有瀉下攻積,清熱瀉火,涼血解毒,逐瘀通經(jīng),利濕退黃的功效。用于實(shí)熱積滯便秘,血熱吐衄,目赤咽腫,癰腫疔瘡,腸癰腹痛,瘀血經(jīng)閉,產(chǎn)后瘀阻,跌打損傷,濕熱痢疾,黃疸尿赤,淋證,水腫;外治燒燙傷[3-4]。統(tǒng)計(jì)表明,《中國藥典》2020年版一部收載的中成藥處方中涉及大黃及其炮制品的品種有160 余種,由此可見,大黃藥材應(yīng)用廣泛。作為用藥歷史悠久的常用中藥材,近年來隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷推進(jìn),大黃藥材市場需求量不斷增加,但由于藥材資源相對(duì)有限,導(dǎo)致目前市場上的商品大黃中?;煊型瑢佼惙N植物的根冒充大黃藥用的現(xiàn)象,以華北大黃、河套大黃等非正品大黃較為常見。研究表明,與正品大黃所含番瀉苷類成份不同的是,這些摻偽混用的大黃所含特征性成份為二苯乙烯苷類化合物,又以土大黃苷為代表性成份[5-9]。隨著藥品監(jiān)管力度的不斷加大[10],國家藥品監(jiān)督管理局已批復(fù)了大黃補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目(批準(zhǔn)件編號(hào):2010001),并陸續(xù)頒布了增加土大黃苷檢查項(xiàng)的中成藥藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,如三黃片、牛黃解毒片、炎可寧片等,有效控制了相關(guān)品種的大黃摻偽問題。在此基礎(chǔ)上,《中國藥典》自2015年版一部起,大黃檢查項(xiàng)中土大黃苷的檢查方法修訂為更為靈敏準(zhǔn)確的薄層色譜法(TLC)。此外,多個(gè)含大黃中成藥品種分別研究建立了土大黃苷的檢查方法,主要以薄層色譜法和高效液相色譜法(HPLC)為主[11-16]。
本文研究建立了牛黃消炎片中土大黃苷的系列檢測方法,包括采用 TLC 法對(duì)牛黃消炎片中土大黃苷進(jìn)行快速篩查,并進(jìn)一步采用 HPLC 和HPLC-MS/MS 法進(jìn)行驗(yàn)證,以充分保障檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果顯示,來自14 家生產(chǎn)企業(yè)的60 批樣品經(jīng) TLC 快速篩查有17 批樣品中檢出土大黃苷成份,并進(jìn)一步經(jīng)HPLC 和HPLC-MS/MS 法對(duì)保留時(shí)間、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜裂解行為等相關(guān)信息進(jìn)行了確證,表明牛黃消炎片個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)存在大黃摻偽混用的情況,該系列檢測方法為藥品監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。
CAMAG自動(dòng)點(diǎn)樣儀、CAMAG-Reprostar 3 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司);Waters2695 高效液相色譜系統(tǒng)(包括Waters 2695 液相色譜儀、Waters2996 DAD 紫外檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器及EMPOWER 2 工作站)(美國沃特世公司);Agilent 1200-6320 Ion trap 液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司);Millipore 濾水機(jī)(美國密理博公司);AE240 型電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)。
土大黃苷對(duì)照品( 批號(hào)110794-201105)、人工牛黃對(duì)照藥材(批號(hào)121197-201204)、珍珠母對(duì)照藥材(批號(hào)121500-200501)、蟾酥對(duì)照藥材(批號(hào)121132-200803)、青黛對(duì)照藥材(批號(hào)121170-201102)和天花粉對(duì)照藥材(批號(hào)121361-201202)均來自中國食品藥品檢定研究院;雄黃購于北京同仁堂股份有限公司;牛黃消炎片樣品來自14 家生產(chǎn)企業(yè)A~N,共60 批,樣品情況詳見表1;甲苯、甲酸乙酯、丙酮、甲酸和甲醇均為分析純(北京化學(xué)試劑公司);聚酰胺薄膜(浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);乙腈和甲醇為色譜純(美國Thermo Fisher 公司)。
表1 牛黃消炎片樣品基本信息
續(xù)表
2.1.1 對(duì)照品溶液
精密稱取土大黃苷對(duì)照品適量,加甲醇制成每1ml 含0.1mg、0.08mg 的溶液,分別作為TLC、HPLC 檢查用對(duì)照品溶液。
分別取人工牛黃、蟾酥、天花粉、雄黃、珍珠母和青黛對(duì)照藥材適量,按處方制得缺大黃陰性對(duì)照樣品,取適量,加甲醇5ml,超聲(功率:300W,頻率:40kHz)30min,0.45μm 微 孔濾膜濾過,得到陰性對(duì)照溶液。
2.1.2 供試品溶液
取牛黃消炎片10 片,除去包衣,研細(xì),加甲醇5ml,超聲(功率:300W,頻率:40kHz)30min,0.45μm 微孔濾膜濾過,得到供試品溶液。
2.2.1 色譜條件
薄層板:聚酰胺薄膜;展開劑:甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲酸-甲醇(30: 5: 5: 0.1: 20);檢視:紫外 UV 366nm 下檢視;點(diǎn)樣量:5μl。
2.2.2 結(jié)果
取TLC 檢查用對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液和供試品溶液各5μl,分別點(diǎn)樣于聚酰胺薄膜上,參照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)試驗(yàn)。按2.2.1 檢視條件檢視,結(jié)果60批測試樣品中有17 批在與土大黃苷對(duì)照品Rf值一致的位置有相同顏色的熒光斑點(diǎn)檢出。部分樣品TLC 結(jié)果,如圖1所示。
圖1 牛黃消炎片樣品、對(duì)照品與陰性對(duì)照TLC 色譜圖(UV 366 nm)
2.3.1 色譜條件
色譜柱:PrevailTMC18 (250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水(30: 7: 63);流速:1.0 ml/min;柱溫:30℃;檢測波長:320nm;進(jìn)樣量:10μl。理論塔板數(shù)按土大黃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
2.3.2 檢測限
取HPLC 檢查用對(duì)照品溶液,加甲醇逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測定,取信噪比(S/N)為3 ∶1時(shí)的濃度為檢出限,結(jié)果為0.008μg/ml。
2.3.3 結(jié)果
取TLC 檢查陽性供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。供試品溶液在與土大黃苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的位置均有色譜峰檢出,同時(shí)提取該色譜峰的光譜圖,結(jié)果顯示在280~400nm 波長范圍的吸收光譜與土大黃苷對(duì)照品一致。代表性樣品HPLC 色譜圖如圖2、圖3所示。
圖2 代表性樣品、對(duì)照品與陰性對(duì)照HPLC 色譜圖
圖3 紫外吸收光譜圖
2.4.1 色譜條件
同HPLC 法 2.3.1 項(xiàng)下。
2.4.2 質(zhì)譜檢測參數(shù)
電噴霧(ESI)離子化源;電離模式:負(fù)離子模式,全掃描模式;離子掃描范圍:m/z100~500;霧化氣:25psi;干燥氣:12L/min;干燥溫度:320℃;分流比:1: 9。
2.4.3 結(jié)果
在上述色譜與質(zhì)譜條件下,土大黃苷對(duì)照品的準(zhǔn)分子離子峰m/z419 [M-H]-,保留時(shí)間為19.4min;對(duì)該分子離子峰m/z419 [M-H]-進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z257 [M-H-162]-,為丟失 葡萄糖基產(chǎn)生的碎片離子。17 批陽性樣品經(jīng)HPLC-MS/MS 分析,結(jié)果與土大黃苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰均能檢測到m/z419 [M-H]-,即土大黃苷的準(zhǔn)分子離子峰,進(jìn)一步對(duì)m/z419 [M-H]-進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,則均產(chǎn)生與對(duì)照品一致的碎片離子峰,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4所示。
圖4 土大黃苷的二級(jí)質(zhì)譜圖
綜合上述薄層色譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本次抽檢的14 家生產(chǎn)企業(yè)60 批樣品中,有17 批檢出土大黃苷,涉及4 家生產(chǎn)企業(yè),具體結(jié)果詳見表2。
表2 牛黃消炎片中檢出土大黃苷成份結(jié)果情況
續(xù)表
牛黃消炎片中土大黃苷檢查結(jié)果反映了處方中涉及的大黃藥味存在一定程度的摻偽混用問題。本研究充分結(jié)合摻偽大黃中代表性成份土大黃苷的二苯乙烯苷結(jié)構(gòu)特征,選取對(duì)此類成份具有良好分離效果的聚酰胺薄膜作為薄層板,利用其熒光特性進(jìn)行檢視,能夠較好地排除干擾。此外,鑒于牛黃消炎片處方藥味多,所含化學(xué)成份復(fù)雜等特點(diǎn),本研究進(jìn)一步建立了HPLC 和HPLCMS/MS 驗(yàn)證方法,能夠進(jìn)一步對(duì)保留時(shí)間、紫外吸收光譜、二級(jí)質(zhì)譜測定等多方面信息進(jìn)行綜合比對(duì)分析。上述系列檢查方法適用于大量樣品的快速篩查,能夠保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性,為藥品質(zhì)量監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持,對(duì)保障人民群眾用藥安全與有效具有重要意義。