李而珍 黃覺 李志賢 虞與理

（廣西賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西賀州 542899）

1 前言

羊布魯氏菌病又被稱為布病，它是由布魯氏菌引起的人畜共患的一種慢性傳染病，主要侵害生殖系統(tǒng)。羊感染后，以母羊發(fā)生流產(chǎn)和公羊發(fā)生睪丸炎為特征，主要有發(fā)熱、流產(chǎn)、睪丸炎癥、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。該病分布很廣，除了危害羊之外，不僅感染各種家畜，而且易傳染給人，危害人類的身體健康。為了更好的防范該種傳染性疾病的傳播流行，需要做好妥善的疫苗免疫接種工作和疫情的檢測(cè)篩查。在羊布魯氏桿菌病診斷過程中常用的檢測(cè)方法，主要包括了虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)等。

某市對(duì)某羊場(chǎng)進(jìn)行布病日常監(jiān)測(cè)，采集了20份血液，檢出4份陽(yáng)性。某市對(duì)該羊場(chǎng)進(jìn)行了全場(chǎng)采樣，并通過對(duì)該羊場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析，對(duì)附近與該羊場(chǎng)有配種、放牧等接觸的21個(gè)羊場(chǎng)也進(jìn)行了全場(chǎng)采樣，共采集新鮮血液1745份，將其放置在4℃的溫箱當(dāng)中進(jìn)行保存，在試驗(yàn)操作過程中，首先對(duì)采集到的血液進(jìn)行血清分離得到的血清進(jìn)行編號(hào)處理（編號(hào)1-1745），然后進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，研究不同學(xué)清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)布魯氏桿菌病的檢測(cè)效果。

2 虎紅平板凝集試驗(yàn)

按照布魯氏桿菌診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（GB/T18646-2002動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù) 虎紅平板凝集試驗(yàn)），在檢測(cè)過程中主要涉及到的試劑為虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原和陰陽(yáng)性對(duì)照血清，在玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號(hào)，然后加受檢血清30μL，在受檢血清旁滴加抗原30μL，用牙簽類小棒攪拌血清和抗原使之混合，同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照血清，在4min內(nèi)進(jìn)行判定，在陰、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下，對(duì)被檢血清進(jìn)行判定，出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽(yáng)性（+），無(wú)凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。經(jīng)檢測(cè)1745份羊血清，103份為陽(yáng)性，1642份為陰性。

3 試管凝集試驗(yàn)

按照布魯氏桿菌診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（GB/T18646-2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù) 試管凝集試驗(yàn)），在檢測(cè)過程中主要涉及到的試劑為布魯氏桿菌試管凝集試驗(yàn)抗原和陰陽(yáng)性對(duì)照血清、0.5%石炭酸的10%氯化鈉溶液，毎份血清用4支凝集試管，分別加入稀釋液、陰陽(yáng)對(duì)照血清、受檢血清，從第1至第4管依次做稀釋，血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50、1：100，將稀釋好的抗原液500μL分別加人已稀釋好的各管血清中，羊血清稀釋度則依次變?yōu)?：25、1：50、1：100、1：200，并做抗原對(duì)照和參照比濁管，將加樣后的試管置溫箱（37℃±1℃）孵育18～24h。

凝集反應(yīng)程度應(yīng)根據(jù)參照比獨(dú)管來判讀，分別記為“++++” “+++”“++”“+”“-”。++++菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；+++菌休幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；++菌體凝集顯著，液體50%清亮；+有凝集物沉淀，液體25%清亮；-無(wú)凝集物，液體均勻混濁。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清出現(xiàn)完全凝集（++++），陰性對(duì)照血清無(wú)凝集（一），抗原對(duì)照無(wú)自凝（一）現(xiàn)象時(shí)，試驗(yàn)成立。結(jié)果判定：1：50血清稀釋度，出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象時(shí)，判定為陽(yáng)性，1：25血清稀釋度，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，判定為可疑。將虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選出的103份陽(yáng)性血清進(jìn)行試驗(yàn)，如下表（其中10份）：

經(jīng)判定76份血清在1：50血清稀釋度，出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象，判定為陽(yáng)性；21份血清在1：25血清稀釋度，出現(xiàn)“++” 以上凝集現(xiàn)象，判定為可疑；6份判定為陰性。

4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)

按照羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)試劑盒（EILSA）中的相關(guān)說明進(jìn)行嚴(yán)格的操作，在檢測(cè)過程中主要涉及到的試劑為布魯氏菌競(jìng)爭(zhēng)抗體、酶標(biāo)抗體、布魯氏菌陰陽(yáng)性對(duì)照血清、底物溶液、終止液等，每孔加入40uL工作濃度的洗滌液，分別在對(duì)應(yīng)孔中加入陰陽(yáng)性對(duì)照血清和受檢血清，每孔加入50uL的競(jìng)爭(zhēng)抗體混勻，37℃孵育60min，拿出抗原包被板甩干孔中的液體，每孔加入300ul工作濃度的洗滌液，洗滌3次，拍干后每孔加入100uL的酶標(biāo)抗體，37℃孵育30min，按上步驟再次洗滌后，每孔加入50uL底物溶液A，再加入50uL底物溶液B，37℃避光孵育10～15min，每孔加入50uL的終止液終止顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的OD值。將虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選出的103份陽(yáng)性血清進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)檢測(cè)103份血清的OD值，如下表：

結(jié)果判定：陰陽(yáng)性血清和受檢樣品的平均OD值分別為ODNC、ODPC、ODS，陽(yáng)性血清抑制率=（ODNC-ODPC）/ODNCx100%，樣品抑制率=（ODNC-ODS）/ ODNCx100%。ODNC值應(yīng)>0.5且陽(yáng)性血清抑制率應(yīng)>60%，試驗(yàn)結(jié)果有效，否則重新進(jìn)行試驗(yàn)。樣品抑制率≥50%判為陽(yáng)性，樣品抑制率<50%判為陰性。經(jīng)計(jì)算陽(yáng)性血清抑制率為89.9%（表1）、89.5%（表2），試驗(yàn)結(jié)果有效，對(duì)103份受檢樣品進(jìn)行計(jì)算，102份為陽(yáng)性，1份為陰性。

表1

表2

5 討論

三種試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，如下圖：

以上三種試驗(yàn)在操作過程中，不同的試驗(yàn)有著不同的診斷技術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)的精確性也存在一定差異，同時(shí)也存在人為對(duì)試劑配制和操作的因素，特別是試管凝集試驗(yàn)在操作過程中相對(duì)比較復(fù)雜，整個(gè)試驗(yàn)過程相對(duì)較長(zhǎng)，在進(jìn)行結(jié)果判定過程中很容易受到相關(guān)人員的主觀因素影響而出現(xiàn)較大的誤差。在試驗(yàn)操作過程中應(yīng)按照診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行嚴(yán)格的操作。

虎紅平板凝集試驗(yàn)主要是快速凝集反應(yīng)，更適合流行病學(xué)的篩查，用于檢測(cè)動(dòng)物是否感染布魯氏菌病。試管凝集試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)，主要應(yīng)用于感染動(dòng)物的臨床診斷及布魯氏菌病的確診診斷。試管凝集試驗(yàn)，用時(shí)較長(zhǎng)，操作相對(duì)較復(fù)雜，結(jié)果可疑的家畜還需經(jīng)30d后采血重檢，但是凝集試驗(yàn)除了判定陰陽(yáng)性，還能判定血清的抗體滴度。競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)，是一種特異性較強(qiáng)的檢測(cè)手段，并且靈敏度較高，操作較為簡(jiǎn)單，一次性能夠完成大量樣本的檢測(cè)。診斷布魯氏菌病的標(biāo)準(zhǔn)是找到病原體，但是布魯氏菌的血培養(yǎng)或者骨髓培養(yǎng)的陽(yáng)性率是有限的，更多依賴的就是免疫學(xué)方面的檢測(cè)。在進(jìn)行布魯氏菌病抗體檢測(cè)過程中，三種試驗(yàn)都是當(dāng)前階段采用的方法，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用性，通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，一般還要結(jié)合患者的流行病學(xué)病史來綜合考慮是否患有布魯氏菌病。