張 穎 孫冬冬 趙 靜 周永燚 袁雪濤 王芳霞 哈子明

（1.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402； 2.濱海新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，天津 300480）

豬塞內(nèi)卡病毒病是由A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）引起的一種以鼻鏡、蹄部冠狀帶處出現(xiàn)水泡、潰爛創(chuàng)面等特征的動物傳染病，不同年齡階段的豬均易感。病豬臨床癥狀與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎相似而常被忽略，目前該病沒有商品化疫苗，制約養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失，因此近幾年備受關(guān)注。本研究通過對天津地區(qū)豬群塞內(nèi)卡病毒病流行病學調(diào)查，為進一步研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2021年3～9月采自天津市寶坻區(qū)、寧河區(qū)、西青區(qū)等區(qū)域3個大型屠宰場和寧河、寶坻2個無害化處理場的樣品，其中血清樣本共計839份，全血采集后，盡快分離血清，-20℃冷凍保存，備用。組織、口腔棉拭子樣本共計404份，將采集的口腔/泄殖腔棉拭子放入含1ml生理鹽水的無菌EP管中，組織放入采樣袋中，編號后冷藏備用具體信息如下（表1、表2）。

表1 血清樣本統(tǒng)計

表2 組織病料樣本統(tǒng)計

1.2 主要試劑和耗材

微量加樣器thermo；加液槽；去離子水；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9052AE；全自動洗板機Thermo；酶標分析儀Sunshine；吸水紙；塞內(nèi)卡病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒購自蘭州獸醫(yī)研究所。生物安全柜Haier；離心機Thermo；實時定量熒光PCR儀QuanStdio 6 Flex；SimlyP病毒DNA/RNA共提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；塞內(nèi)卡病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒購自達安科技；PBS溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 血清學檢測方法

1.3.1 洗滌液的準備

使用前濃縮洗滌液用去離子水25倍稀釋，可在2～8℃條件下保存7d。

1.3.2 樣品的準備

用樣品稀釋液30倍稀釋待檢樣品。每個樣品在添加到反應板前應混勻。注意：不要稀釋陰陽性對照。取樣后需更換吸頭。

1.3.3 血清抗體檢測

按照塞內(nèi)卡病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒說明書的要求進行操作。

1.3.4 結(jié)果判定

當S/P 0.4判定結(jié)果為陰性；當 S/P≥0.4判定結(jié)果為陽性。

1.4 病原學檢測方法

1.4.1 樣本處理

利用無菌鑷夾取待檢病死或屠宰豬的脾臟、肺臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織2.0g于研磨器中充分研磨，加入PBS 10ml充分研磨混勻，將組織懸液轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管中3000rpm離心10min，離心取上清液轉(zhuǎn)入Eppendoff管中，編號備用。鼻拭子、肛拭子放入盛有1.0ml PBS 的Eppendoff管中，編號備用。

1.4.2 病毒核酸的提取

參照SimlyP病毒DNA/RNA共提取試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 病原學檢測

按照A型塞內(nèi)卡病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書進行操作。取N個（N=待測樣本個數(shù)+陰性質(zhì)控品+SVA陽性質(zhì)控品）PCR反應管。按照以下擴增體系進行配置：

質(zhì)量控制：

（1）陰性質(zhì)控品：FAM檢測通道無明顯擴增曲線。

（2）陽性質(zhì)控品：FAM檢測通道有明顯擴增曲線，且Ct值≤32

同時滿足以上要求，實驗成立。

（3）結(jié)果判定

若檢測樣品FAM通道無擴增曲線或Ct值＞38，判定樣品為A型塞內(nèi)卡病毒陰性；

若檢測樣品FAM通道無擴增曲線且Ct值≤38，判定樣品為A型塞內(nèi)卡病毒陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SVA血清學檢測結(jié)果

血清學共檢測樣本839份，結(jié)果顯示：天津地區(qū)3個屠宰場SVA血清樣本陽性樣本數(shù)為0，抗體陽性率為0%（表3）。

表3 血清學檢測結(jié)果

2.2 SVA病原學檢測結(jié)果

病原學共檢測樣本404份，結(jié)果顯示：天津地區(qū)3個屠宰場、2個無害化處理場SVA病料樣本陽性樣本數(shù)為0，陽性樣本率為0%（表4）。

3 討論

單純使熒光定量RT-PCR方法檢測豬塞內(nèi)卡病毒，只能通過檢測病毒核酸來直接檢測病毒，這對正處于病毒感染階段且體內(nèi)具有一定病毒含量的個體是易于檢出的，但對感染過程已經(jīng)結(jié)束或者感染雖然持續(xù)存在但體內(nèi)病毒含量很低的個體則難以檢出，而抗體檢測則可以解決這個難題，故兩種方法聯(lián)合使用無疑會使檢測結(jié)果更加全面和準確。

本研究采用SVA血清學和病原學方法，對天津地區(qū)部分屠宰場和無害化處理場采集的血清樣本、組織樣本進行檢測，結(jié)果顯示，血清樣本和組織樣本中均未檢出SVA陽性。高春柳[1]等利用實時熒光定量RT-PCR和ELISA方法，對華東、華南、華中、華北、西北、東北6個地區(qū)16個省市自治區(qū)屠宰場和非健康豬場采集的1310份組織樣品和828份血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示，華東、華南、華中、華北、西北、東北地區(qū)組織樣品陽性率分別為4.07%、17.06%、29.27%、0、2.65%、0，華東、西北地區(qū)血清樣品陽性率分別為6.98%、15.17%，其中華北地區(qū)均為陰性，而華北地區(qū)采樣集中在天津地區(qū)、河北省，未出現(xiàn)感染情況，與本研究所得出的結(jié)論一致，但華中、華南、華東等地區(qū)均有不同程度的感染。穆國冬等[2]人利用間接ELISA和熒光定量RT-PCR方法對吉林省7個縣規(guī)模豬場和生豬屠宰場采集的420份樣品進行檢測，結(jié)果顯示，抗體陽性率6.2%，病原陽性率4.8%，說明該病在吉林省已經(jīng)出現(xiàn)區(qū)域性流行，具有一定的感染趨勢。熊杰等[3]人利用實時熒光RT-PCR方法對攀枝花地區(qū)送檢的100份血清進行檢測，結(jié)果顯示，所有樣品均為SVA抗原陰性，說明攀枝花地區(qū)尚未出現(xiàn)SVA感染。

4 結(jié)論

本研究檢測表明，天津地區(qū)豬塞內(nèi)卡病毒病尚未出現(xiàn)感染，但該病目前沒有商品化疫苗，絕不可掉以輕心，因此豬場要加強疫病的防控，做好科學的飼養(yǎng)管理和嚴格的生物安全措施。同時，有關(guān)部門和機構(gòu)要高度重視該病的防控，加強檢疫監(jiān)管，開展回溯性研究和主動監(jiān)測工作。