席自中，宋彥，宋元貞，張依璐

腦小血管?。–SVD）是由顱內(nèi)小血管（包括小動(dòng)脈、微動(dòng)脈、毛細(xì)血管、小靜脈和微靜脈）發(fā)生病理改變而引起的一組疾病。CSVD 的病理生理改變包括血管壁改變、血-腦脊液屏障功能受損、腦灌注下降、血管運(yùn)動(dòng)反應(yīng)性降低、水腫、缺血、神經(jīng)纖維脫髓鞘和小膠質(zhì)增生等［1-2］。在影像學(xué)上，CSVD 可表現(xiàn)為腔隙性腦梗死、腦白質(zhì)病變及腦微出血。卒中、癡呆、老齡化被認(rèn)為是最常見的CSVD 發(fā)病危險(xiǎn)因素，CSVD 會(huì)對(duì)血管壁造成一定的損傷，在腦室周圍有大量的血漿蛋白進(jìn)入，血-腦屏障發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腔隙性腦梗死等疾病的發(fā)生［3］。和其他類型的腦卒中相比，CSVD 所致的腦卒中雖然較輕，但長期的預(yù)后效果較其他類型的腦卒中相對(duì)較差。目前CSVD的發(fā)病率逐年增加，但治療CSVD還沒有更為有效的辦法，因此治療CSVD 的有效方法是當(dāng)今臨床上研究的熱點(diǎn)。粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是一種調(diào)節(jié)骨髓粒系造血細(xì)胞的細(xì)胞因子，其造血功能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)尤為重要，G-CSF 及其受體在腦組織中大量存在［4-5］。有文獻(xiàn)證實(shí)G-CSF 對(duì)缺血再灌注損傷大鼠的腦組織具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制是通過對(duì)血管內(nèi)皮增生修復(fù)的有效促進(jìn)來實(shí)現(xiàn)［6］。神經(jīng)元核抗原（NeuN）是一種特異性蛋白質(zhì)，存在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，主要表達(dá)于神經(jīng)與細(xì)胞核和細(xì)胞漿中［7］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，NeuN存在人早期胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在神經(jīng)元大部分NeuN 呈高表達(dá)，少部分為低表達(dá)和陰性表達(dá)［8］。有關(guān)NeuN 在CSVD 中的分布未見報(bào)道，因此本研究于2020 年1 月至2021 年1 月探究G-CSF 對(duì)CSVD 大鼠神經(jīng)元活性、血管超微結(jié)構(gòu)和NeuN 陽性表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所用大鼠均從北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以有限公司購買，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0002。SD 雄性大鼠40 只，24 周齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量范圍為300～350 g。所有大鼠飼養(yǎng)在20～25 ℃的環(huán)境中，相對(duì)濕度保持在50%～65%，保持環(huán)境相對(duì)安靜，12 h光照晝夜交替，大鼠自由進(jìn)食攝水。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 試劑和儀器本實(shí)驗(yàn)所有試劑和儀器分別為杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn)的G-CSF 注射液；美國Vector 公司生產(chǎn)的小鼠抗大鼠NeuN 單克隆抗體；武漢塞維爾生物科技有限公司生產(chǎn)的兔抗GAPDH 抗體；艾比瑪特德國LEICA 公司生產(chǎn)的LEICA CRYCUT1800 型冰凍切片機(jī)；日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的FV1000 型熒光顯微鏡；武漢博士德生物公司生產(chǎn)的免疫組織化學(xué)試劑盒和蘇木精-伊紅染色（HE染色）試劑盒。

1.3 動(dòng)物分組和CSVD 模型的制備采用隨機(jī)數(shù)字表法將40 只大鼠分為假手術(shù)組10 只和模型組大鼠30只。將模型組大鼠制備CSVD大鼠模型。制備自體血漿：采取大鼠左心室血液，將血液經(jīng)80 ℃高溫干燥后研磨，在200 μm 的篩孔中過濾，制備成栓子，在造模時(shí)將栓子和鹽水混合為混懸液。麻醉大鼠后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，剔除頸部毛發(fā)后消毒，在正中位置切一小口，將左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈鈍性分離后暴露在外，在頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉，把頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的位置結(jié)扎，將制備好的栓子混懸液由頸外動(dòng)脈逆近心端逆向推注0.3 mL。將頸總動(dòng)脈處夾子打開，恢復(fù)頸部血流讓栓子從頸內(nèi)動(dòng)脈通過，進(jìn)入到大腦前動(dòng)脈、中動(dòng)脈及大腦側(cè)枝，將頸外動(dòng)脈近心端結(jié)扎后縫合切口、消毒。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：利用激光散斑成像技術(shù)檢測假手術(shù)組和模型組腦血流量，模型組腦血流量較假手術(shù)組明顯減少，表示造模成功［9］，同時(shí)記錄大鼠死亡數(shù)量。在造模過程中模型組大鼠在手術(shù)過程中死亡6 只，在術(shù)后有4 只大鼠死亡，剩余20只造模成功。假手術(shù)組大鼠僅分離頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎，其余手術(shù)步驟同模型組相同。將20 只CSVD 造模成功大鼠平均分為CSVD模型組（CSVD 組）和CSVD 模型大鼠給予G-CSF 干預(yù)治療組（G-CSF 組），每組10 只。造模成功后，將G-CSF 組大鼠經(jīng)皮下注射G-CSF 50 μg/kg，1天1次；假手術(shù)組和CSVD 組大鼠均經(jīng)皮下注射等量的生理鹽水干預(yù)，1天1次，三組大鼠均連續(xù)注射7 d。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)圖片（蘇木精-伊紅染色×400）

圖2 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況（TUNEL檢測×400）

1.4 標(biāo)本取材麻醉各組大鼠，將大鼠仰臥位固定手術(shù)臺(tái)，打開胸腔將心臟充分暴露在外，將灌注針頭經(jīng)心尖緩慢插入到主動(dòng)脈，止血鉗夾緊后用生理鹽水灌注，將大鼠右心耳剪開，發(fā)現(xiàn)流出的液體呈清涼時(shí)停止灌注；停止后將多聚甲醛注入，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大鼠的四肢變白、身體僵硬時(shí)斷頭處死大鼠，立即取出大鼠腦組織，分離額葉皮質(zhì)腦組織用于電鏡觀察；剩下的腦組織用于HE 染色、NeuN 免疫組織化學(xué)染色及TUNEL染色。

1.5 HE 染色觀察海馬組織形態(tài)變化將三組大鼠分別麻醉致死，取出大鼠視交叉前后2 mm冠狀切片組織塊，將其固定于甲醛溶液中，用石蠟將組織包埋制成4 μm 石蠟切片，對(duì)切片進(jìn)行HE 染色處理，用中性樹膠對(duì)切片進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察大鼠海馬組織的病理學(xué)變化。

1.6 TUNEL 檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡分別麻醉三組大鼠，斷頭處死后將大鼠的腦組織取出，用多聚甲醛將腦組織固定，經(jīng)脫水、透明、包埋處理后，制成5 μm 的冠狀切面，實(shí)驗(yàn)操作均按照TUNEL 試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行。細(xì)胞核中凋亡細(xì)胞為棕黃色，在顯微鏡下隨機(jī)選取基底節(jié)不同區(qū)的3 個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 透射電鏡觀察微血管結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮形態(tài)將額葉腦皮質(zhì)制備成1 mm3的組織塊，將組織固定后漂洗組織，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后制成50～60 nm 的薄片；用醋酸鈾一枸櫞酸鉛雙染色，用透射電鏡對(duì)切片組織進(jìn)行觀察。

1.8 免疫熒光染色檢測NeuN表達(dá)水平分別麻醉三組大鼠，打開大鼠胸腔，將右心耳剪開后，將生理鹽水從左心室緩慢灌注，當(dāng)右心耳流出的液體為清涼時(shí)停止灌注，用250 mL 多聚甲醛繼續(xù)灌注，灌注后取出大鼠腦組織，將海馬區(qū)進(jìn)行冰凍并切片。對(duì)切片進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，常規(guī)畫圈，把打孔液加入其中，15 min 后用山羊血液進(jìn)行封閉，1 h 后將NeuN一抗加入，4 ℃環(huán)境孵育過夜后，對(duì)組織進(jìn)行清洗，將山羊抗兔TgG 二抗加入，在室溫下孵育2 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）對(duì)組織再次清洗，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對(duì)切片組織進(jìn)行復(fù)燃，15 min后用甘油將組織封邊。每只大鼠各隨機(jī)選取1張切片進(jìn)行觀察，對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。

1.9 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測NeuN 和VEGF mRNA 表達(dá)分別麻醉三組大鼠，斷頭處死后將海馬組織取出，用Trizol 裂解液對(duì)總的RNA 進(jìn)行提取，用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。引物序列：NeuN 正向引物：5'CACGGCATGACCCTCTACAC 3'，反向引物：5'GTCTGTGCTGCTTCATCTGC 3'；β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）正向引物：5'GTCGTACCACTGGCATTGTG 3'，反向引物：5'TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG 3'；VEGF 正 向 引物：5'TGCCCCTAATGCGGTGT3'，反 向 引 物：5'TGCTGGCTTTGGTGAGGTT3'。反應(yīng)條件：預(yù)熱94 ℃20 s，預(yù)熱72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以± s形式表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化比較假手術(shù)組大鼠腦組織未見結(jié)構(gòu)異常。CSVD 組大鼠腦組織結(jié)果紊亂，海馬區(qū)齒狀回病灶嚴(yán)重，神經(jīng)組織大量壞死，腦皮質(zhì)神經(jīng)元變小，尼氏小體大量消失；干預(yù)后的G-CSF 組大鼠海馬區(qū)較SCVD 組大鼠有明顯改善，神經(jīng)組織壞死數(shù)量減少。見圖1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較假手術(shù)組、CSVD 組、G-CSF 組 細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 為（21.34±4.43）%、（50.31±2.92）%、（30.90±8.10）%（F=69.72，P＜0.001）。與假手術(shù)組相比，CSVD 組增多（P＜0.05），G-CSF組明顯低于CSVD組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 額皮質(zhì)區(qū)微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化假手術(shù)組微血管沒有明顯異常；CSVD 組可見血管管周結(jié)構(gòu)溶解，血管內(nèi)壁粗糙，血管基膜和基質(zhì)之間的間隙增寬，細(xì)胞核大量固縮，線粒體內(nèi)空泡嚴(yán)重；和CSVD組相比，G-CSF組大鼠腦組織微血管得到了明顯改善，管周完整程度較CSVD 組也改善明顯，內(nèi)皮細(xì)胞核核固縮現(xiàn)象也明顯減輕。見圖3。

圖3 各組大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)情況（透射電鏡×12 000）：A為假手術(shù)組；B為腦小血管?。–SVD）組；C為粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）組

2.4 各組NeuN 陽性表達(dá)比較假手術(shù)組、CSVD組、G-CSF 組海馬組織中NeuN 陽性細(xì)胞率分別為（0.572±0.015）%、（0.375±0.020）%、（0.551±0.012）%（F=456.60，P＜0.001）。與假手術(shù)組相比較，CSVD組明顯降低（P＜0.05）；G-CSF 組明顯高于CSVD 組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元核抗原（NeuN）表達(dá)情況（免疫熒光染色×200）

2.5 各組大鼠NeuN 和VEGF mRNA 表達(dá)水平比較與假手術(shù)組相比，CSVD 組大鼠海馬齒狀回NeuN 和VEGF mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與CSVD組相比，干預(yù)后的G-CSF 組大鼠NeuN 和VEGF mRNA表明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠NeuN和VEGF mRNA表達(dá)水平比較/± s

表1 各組大鼠NeuN和VEGF mRNA表達(dá)水平比較/± s

注：NeuN為神經(jīng)元核抗原，VEGF為血管內(nèi)皮生長因子。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與CSVD組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組CSVD組G-CSF組F值P值鼠數(shù)10 10 10 NeuN mRNA 0.48±0.13 0.11±0.04①0.32±0.11①②33.76＜0.001 VEGF mRNA 1.45±0.21 0.76±0.31①1.31±0.26①②19.21＜0.001

3 討論

CSVD 主要累及直徑為30～800 μm 沒有側(cè)肢吻合的解剖終末動(dòng)脈，包括顱內(nèi)小動(dòng)脈、微動(dòng)脈、小靜脈和毛細(xì)血管等，占全部缺血性腦卒中病因的25%～30%，有供血區(qū)域主要在腦深部白質(zhì)及腦干，80 歲以上的老年人腦白質(zhì)信號(hào)基本都高，其中腦微出血發(fā)病率占36%以上［9］。CSVD的發(fā)病相對(duì)隱蔽，在臨床上以缺血性/出血性卒中、認(rèn)知功能障礙等癥狀為主，但其具體的發(fā)病機(jī)制目前還不是十分的明確，因此對(duì)CSVD 的早期預(yù)防和治療是未來臨床研究的主要方向，也能為臨床治療提供可靠依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，CSVD 發(fā)病率主要集中于老年人，其發(fā)生發(fā)展極有可能有外周血內(nèi)皮細(xì)胞的參與［10］。文獻(xiàn)研究顯示，腦小血管內(nèi)皮損傷介導(dǎo)CSVD 的發(fā)病，CSVD 的早期病理生理變化很可能是腦小血管內(nèi)皮損傷［11］。因此，促進(jìn)腦小血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)新生以減輕腦血管損傷可能是治療CSVD的途徑之一。

G-CSF 是一種刺激髓系造血細(xì)胞增殖、分化的生長因子，在臨床上廣泛應(yīng)用，主要常用于中性粒細(xì)胞減少癥［12］。研究證實(shí)，G-CSF 會(huì)透過血-腦屏障和其受體相結(jié)合而發(fā)生系列作用，例如動(dòng)員造血干細(xì)胞、抗細(xì)胞凋亡、抗炎等［13］。近年來發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用G-CSF 治療多種神經(jīng)損傷性疾病，目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段；另外，G-CSF 在多種缺氧缺血性腦損傷新生動(dòng)物模型中被證明在神經(jīng)保護(hù)方面擁有巨大前景［14］。本研究采用同種系微栓子體外注入法制備CSVD 大鼠模型，造模成功后CSVD 組大鼠海馬組織發(fā)生病理性改變，且大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞也出現(xiàn)了大量的凋亡，經(jīng)過G-CSF 干預(yù)后的G-CSF 組和CSVD 組相比，大鼠海馬組織得到明顯改善，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡也得到了明顯抑制，可見G-CSF 可有效改善CSVD 大鼠海馬組織的病理學(xué)改變及抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。肖云月等［15］研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF 可能通過增加VEGF 表達(dá)水平，促進(jìn)腦小血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)，減少神經(jīng)元凋亡，從而減輕原發(fā)性高血壓大鼠CSVD損傷。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞，對(duì)血管的新生進(jìn)行促進(jìn)，改善大腦中動(dòng)脈閉塞；其還會(huì)和神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)進(jìn)行保護(hù)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，CSVD組大鼠微血管損傷嚴(yán)重，給予G-CSF 后血管內(nèi)皮損傷和血管周圍水腫明顯減輕，進(jìn)而證實(shí)了G-CSF 對(duì)血管內(nèi)皮能進(jìn)行有效地保護(hù)。何曉英等［17］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF 可上調(diào)ICH 后VEGF 表達(dá)，增加血腫周圍新生血管生成，改善神經(jīng)功能。NeuN是一種可溶性核蛋白，在體外能與DNA 結(jié)合，識(shí)別神經(jīng)元特異的核蛋白單克隆抗體的產(chǎn)生，已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)元的常用標(biāo)志物，在大鼠大部分神經(jīng)元有明顯的表達(dá)［18］。VEGF 是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及血管形成。本研究發(fā)現(xiàn)CSVD 組大鼠中NeuN 和VEGF mRNA 表達(dá)降低，G-CSF 干預(yù)后大鼠的NeuN 和VEGF mRNA 表達(dá)得到了明顯回升，進(jìn)而猜測G-CSF 通過提高NeuN 和VEGF 表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。有研究證實(shí)，G-CSF 能增強(qiáng)腦組織中VEGF表達(dá)，從而發(fā)揮腦組織的保護(hù)作用［19］。

綜上所述，G-CSF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生修復(fù)、促進(jìn)神經(jīng)元存活而減少凋亡發(fā)生，同時(shí)有效促進(jìn)NeuN的陽性表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

（本文圖1，2，4見插圖9-3）