方麗，王李平，張方圓，李雪瑩，潘云山，張麗，黃嘉穎

(廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東省保健食品功效成分檢測與風險物質快速篩查工程技術研究中心，廣州 510070)

紅糖(brown sugar)指帶蜜的甘蔗成品糖，以甘蔗為原料，經(jīng)提取糖汁、清凈處理后，直接煮煉，不經(jīng)分蜜煉制而成[1]。整個加工過程中不加入除石灰外任何化學試劑及食品添加劑，完全保留甘蔗原有風味和營養(yǎng)物質。紅糖與白砂糖、赤砂糖等精制糖不同，是一種非分蜜糖，即未經(jīng)過分蜜處理制成的糖。在未大規(guī)模生產精制糖時期，甘蔗糖的主要消費形式即非分蜜糖。在全球范圍內有不同的名稱和形態(tài)，廣為人知的是日本沖繩黑糖(Kokuto)、拉丁美洲紅糖(Panela)和南亞、非洲粗糖(Jaggery)等，本質上來說它們都是甘蔗汁的濃縮產物[2]。

紅糖主要成分為蔗糖、果糖、葡萄糖等，另外還含有被認為是益生元的低聚果糖，含量高達500 mg/g[3]。作為甘蔗的全汁濃縮物，紅糖保留了甘蔗中的大部分營養(yǎng)物質，含有具有抗氧化作用的甘蔗多酚，如奎尼酸、原兒茶酸、阿魏酸等多種酚酸[4]。還含有微量的參與人體代謝和細胞調節(jié)的維生素，包括維生素A、維生素E、維生素D、煙酸、泛酸等[5]。陳其釗等[6]的研究表明，紅糖中的植物甾醇含量明顯高于赤砂糖，而植物甾醇對于預防和治療冠狀動脈粥樣硬化、促進傷口愈合等方面具有積極作用。紅糖中包含鐵、鋅、錳、銅、硒等多種微量元素[7]，這些微量元素是人體代謝必需的活性因子。紅糖與其他功能性藥食同源植物合理配伍，能夠增強其保健功效，因此出現(xiàn)了生姜紅糖、益母紅糖等功能性紅糖。除了上述保健作用外，紅糖還具有調節(jié)風味的作用，其中含有幾十種香氣物質[8]。Tian等[9]研究表明紅糖對雞肉調味品的風味品質具有積極影響。Chen Erbao等[10]通過GC-O-MS對紅糖的氣味進行了分析，檢測到豐富的美拉德反應產物(如吡嗪類和呋喃酮類物質)。

丙烯酰胺是一種具有親電基團的有機小分子，對人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和遺傳物質都有一定的毒性[11]，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)將其列為2A類致癌物，即“人類可能致癌物”。天冬酰胺參與的美拉德反應是食品中丙烯酰胺的主要來源[12]，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺主要存在于薯條、面包、咖啡等油炸、焙烤食品中，而紅糖中存在丙烯酰胺鮮有報道。丙烯酰胺的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法，以及新型的檢測技術如基于褐變的快速測定、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫分析技術、生物傳感器法及熒光傳感法[13]。本文以紅糖作為研究對象，優(yōu)化并建立其中丙烯酰胺含量的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 試劑材料

1.1.1 樣品

紅糖樣品選取云南、廣西、廣東、江蘇4個國內主要的紅糖生產地區(qū)所生產的紅糖，以及從兩個國家進口的紅糖。樣品購買后密封于冰箱中冷藏貯存。

1.1.2 標準物質

丙烯酰胺(Acrylamide，簡稱AM，CAS：79-06-1)：1000 μg/mL，介質甲醇，提供商為農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；丙烯酰胺內標(13C3-Acrylamide，簡稱13C3-AM，CAS:287399-26-2)：1000 μg/mL，介質甲醇，提供商為First Standard。

1.1.3 試劑

乙酸乙酯(色譜純，Honeywell)、甲醇(色譜純，Honeywell)、溴化鉀(分析純，廣試)、溴酸鉀(分析純，廣試)、無水硫酸鈉(分析純，廣試，在650 ℃下灼燒4 h，貯存于干燥器中，冷卻備用)、硫代硫酸鈉(分析純，麥克林)、實驗用水為超純水。

1.1.4 基質分散材料

乙二胺-N-丙基硅烷PSA(150 mg MgSO4+50 mg PSA/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB/2 mL)。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 AM標準溶液

取0.25 mL AM標準溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的AM標準溶液，在-18 ℃下保存。

1.2.213C3-AM內標溶液

取0.25 mL13C3-AM標準物質溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的內標溶液，在-18 ℃下保存。

1.2.3 標準工作溶液曲線

分別取0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mL的10 μg/mL AM標準溶液和0.5 mL的10 μg/mL13C3-AM內標溶液于10 mL容量瓶中用超純水定容至10 mL，得10，50，100，200，500，800，1000 ng/mL內標濃度為500 ng/mL的標準工作溶液曲線，臨用時配制。

1.3 儀器設備

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊源) 美國安捷倫科技公司；E320食品料理機 美國Vitamix公司；多位試管渦旋振蕩器 德國Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation；移液器 美國Gilson公司；電子天平 德國Sartorius公司；CF 16RXⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；MPR-210冰箱 日本松下電器(中國)有限公司；50 mL三角瓶、250 mL分液漏斗 博美(北京)玻璃有限公司；比色管(10 mL和100 mL) 天津天?？萍及l(fā)展有限公司。

1.4 樣品前處理

將紅糖樣品放入食品料理機內，打碎混勻后，收集在密封袋中做好標示，備用。稱取5 g(精確至0.001 g)制備樣于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，渦旋10 min后放入冰箱中冷藏待反應。稱取5 g溴化鉀于100 mL比色管中，加入10 mL超純水，渦旋溶解后，依次加入6 mL 10%濃硫酸溶液、冷藏的樣品溶液和20 mL 0.4 mol/L溴酸鉀溶液，避光置于4 ℃冰箱中反應30 min，反應結束后，加入40 mL飽和的硫代硫酸鈉溶液，轉移至250 mL分液漏斗中，用50 mL乙酸乙酯分3次萃取，收集乙酸乙酯層，加入無水硫酸鈉脫水后，氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL。將定容后溶液移入PSA+C18的凈化管內，渦旋1 min，4000 r/min離心3 min后，取上清液，進行GC-MS分析，測試樣品。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣量2 μL，進樣口溫度250 ℃；進樣模式：脈沖不分流；載氣：高純He，純度99.999%；流速：1.2 mL/min；升溫程序：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，再以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

1.5.2 質譜條件

離子源：電子轟擊式離子源(EI，70 eV)；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度240 ℃；溶劑延遲5 min；采集模式：選擇離子檢測(SIM)，AM(151,133,135,106)；13C3-AM(154,152,136,110)，其中帶下劃線的質荷比(m/z)為定量離子，其余3個為定性離子。

2 結果與討論

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

丙烯酰胺溶于水，且紅糖在水中易于溶解，因此直接將紅糖樣品經(jīng)渦旋溶解于超純水后，用于溴化衍生。由于衍生產物2,3-二溴丙酰胺微溶于水，易溶于乙酸乙酯，且有機化合物在兩種溶劑中的分配系數(shù)介于0.1～100之間，用一定量的溶劑分批多次萃取的效率要比一次萃取效率高，因此衍生結束后，加入飽和的硫代硫酸鈉消除多余的溴單質，采用50 mL乙酸乙酯分3次對衍生產物進行萃取，收集乙酸乙酯層，脫水、濃縮、凈化后，用GC-MS進行分析。

由于丙烯酰胺在熔點溫度時很容易聚合，氣相色譜無法實現(xiàn)對其低濃度含量的分析。且其相對分子量僅為71，離子化碎片主要為71，55，44，27，碎片m/z小，進行GC-MS分析時，干擾較大。因此，采用溴化加成，使丙烯酰胺轉換為2,3-二溴丙酰胺，增加了丙烯酰胺的熱穩(wěn)定性以及對檢測器的靈敏度和選擇性，再用GC-MS進行分析。

溴單質的獲取途徑為溴化鉀-溴酸鉀與濃硫酸混合反應。利用在極性溶劑中，溴容易發(fā)生異裂，生成溴離子，與丙烯酰胺中的烯鍵發(fā)生加成反應，生成2,3-二溴丙酰胺，反應結束后，用硫代硫酸鈉溶液除去多余的溴單質，反應方程式如下：

5KBr+KBrO3+3H2SO4=3Br2+3H2O+3K2SO4。

CH2=CHCONH2+Br2=CH2BrCHBrCONH2。

Na2S2O3+4Br2+5H2O=Na2SO4+H2SO4+8KBr。

由于加入的溴化鉀和溴酸鉀過量，能夠滿足衍生反應要求，反應過程所涉及的關鍵因素為濃硫酸溶液的加入量、反應溫度以及反應時間。

2.1.1 影響溴化加成反應轉化率的單因素實驗考察

先通過單因素實驗分別對這3個因素進行五水平實驗考察。首先對最主要的因素——濃硫酸加入量進行考察，分別選取10%濃硫酸加入量為2，4，6，8，10 mL這5個水平，反應溫度4 ℃，反應時間30 min，以不同水平實驗作為橫坐標、相對響應值作為縱坐標，繪制濃硫酸溶液加入量對反應結果影響的單因素實驗曲線，見圖1。

圖1 濃硫酸溶液的加入量對結果的影響

由圖1可知，隨著10%濃硫酸加入量的逐漸增大，反應轉化率呈上升趨勢，當加入量超過8 mL時，繼續(xù)增加加入量，相對響應值無明顯變化，故選擇10%濃硫酸的加入量為8 mL。

考察不同溫度下溴化加成反應轉化率。丙烯酰胺極易升華和聚合，在室溫條件下穩(wěn)定。用于反應的溴單質在常溫、常壓下是具有揮發(fā)性的紅黑色液體，且溴蒸氣具有腐蝕性、有毒。因此，根據(jù)丙烯酰胺和溴單質的理化性質，考察溫度時分別選取0，4，8，12，16 ℃這5個水平，加入8 mL的10%濃硫酸，反應時間30 min，以不同水平實驗作為橫坐標、相對響應值作為縱坐標，繪制溫度對反應結果影響的單因素實驗曲線，見圖2。

圖2 反應溫度對結果的影響

由圖2可知，當溫度為4 ℃時，相對響應值最大，隨著反應溫度的上升，相對響應值反而下降，可能與丙烯酰胺的穩(wěn)定性有關。

考察不同時間下溴化加成反應轉化率?？疾旆磻獣r間時分別選取10，20，30，40，50 min這5個水平，加入8 mL的10%濃硫酸，反應溫度為4 ℃，以不同水平實驗作為橫坐標、相對響應值作為縱坐標，繪制時間對反應結果影響的單因素實驗曲線，見圖3。

圖3 反應時間對結果的影響

由圖3可知，隨著反應時間的增加，相對響應值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，當時間為40 min時，相對響應值達到峰值，因此選擇反應時間為40 min。

單因素實驗存在各因素之間沒有交互作用這個假定，而在實際問題中，各因素相互獨立的情況極少。在單因素實驗結論的基礎上，同時采用響應面設計進行三因素三水平實驗，對衍生條件進行進一步優(yōu)化。

2.1.2 影響溴化加成反應轉化率的響應面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken Design的中心組合設計原理，結合單因素實驗結果，進行三因素三水平的響應面分析實驗，因素和水平選擇見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

以10%濃硫酸加入量(A)、反應溫度(B)和反應時間(C)為自變量，以反應后產物2,3-二溴丙酰胺的響應值比率為響應值(Y)進行響應面分析實驗，分析方案及結果見表2。

表2 響應面分析方案及實驗結果

通過Design-Expert軟件程序進行二次回歸響應分析，建立多元二次響應面回歸模型：Y=11.21A+3.92B-0.18C-8.09AB+1.29AC+3.8BC-9.37A2-15.28B2-9.81C2，對其進行顯著性檢驗與方差分析，見表3。

表3 二次響應面回歸模型方差分析

由表3可知，回歸模型的P值<0.001，表明該模型回歸效果顯著，可反映實際結果的R2=0.9929，表明模型的擬合結果與實際結果相關度高，失擬項的P值為0.2673>0.05，表明該回歸方程擬合度較高，誤差對實驗結果影響較小。在所有作用因素中，一次項A、交互相AB以及二次項 A2、B2、C2對目標化合物的反應轉化率影響極顯著(P<0.001)。由表3中F值可知，各因素對溴化加成反應轉化率影響大小順序為：10%濃硫酸加入量(A)>反應溫度(B)>反應時間(C)。

利用Design Expert軟件，通過多元回歸方程做出響應面圖，見圖4。因素間交互效應的強弱可由等高線圖的形狀來分析。等高線圖越接近于橢圓，表明因素之間的交互作用越強烈[14]。

圖4 兩因素交互影響反應轉化率的響應面

由圖4可知，10%濃硫酸加入量和反應溫度(AB)的交互作用最為顯著，其次是10%濃硫酸加入量和反應時間(AC)，影響最小的為反應溫度與反應時間(BC)。最終確定溴化加成反應的條件為10%濃硫酸加入量為8 mL，反應溫度為4 ℃，反應時間為40 min，并以2,3-二溴丙酰胺標準物質(CAS:15102-42-8)作為基準，確定反應產物濃度，得到上述條件下的反應轉化率為98.7%，完全滿足方法要求。

2.2 凈化條件的確定

由于紅糖所包含的成分較多，在衍生化反應過程中，亦會引入部分雜質，在GC-MS分析時體現(xiàn)為雜峰多、基線上升，從而影響定量、定性結果的準確性。該實驗凈化利用基質分散萃取機理，采用吸附劑與碳水化合物等干擾物結合，通過離心方式去除，從而達到凈化的目的。比較了3種不同的混合型基質分散凈化物，乙二胺-N-丙基硅烷PSA、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB。3種基質分散凈化物均能有效去除干擾，降低基線，減少雜峰數(shù)目，明顯改善AM、13C3-AM峰高，其中PSA+C18的改善效果最為明顯，凈化前后對比見圖5。

圖5 紅糖樣品凈化前后對比

2.3 色譜條件優(yōu)化

丙烯酰胺溴化加成的產物2,3-二溴丙酰胺作為有機鹵化物，屬于極性分子，根據(jù)相似相溶原理，選取具有強偶極力的聚乙二醇(PEG)作為固定相，2,3-二溴丙酰胺具有較高的沸點，且在WAX色譜柱上240 ℃左右出峰，而Heavywax屬于耐高溫的WAX色譜柱，溫度上限為恒溫280 ℃，高于一般的WAX色譜柱，能夠有效地縮短運行時間，且在高溫段的后段運行烘烤色譜柱，有助于將氣化進入色譜柱的高沸點物質趕出，有助于減少樣品的基質效應，降低交叉污染以及出現(xiàn)鬼峰的風險。對于典型的需要低載氣流速的GC-MS系統(tǒng)，選擇0.25 mm內徑較小的色譜柱，因此選擇DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱。柱溫是影響分析時間和分離度的重要因素，采用程序升溫模式能夠有效地使目標物和干擾物分離，獲得準確的結果，由于對單一物質進行分析，階段升溫設置相對簡單：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，再以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。獲得的溴化反應后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺總離子流圖見圖6。

圖6 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺總離子流圖

2.4 質譜條件優(yōu)化

溴化反應后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺在70 eV的能量轟擊下，相應的質譜圖見圖7，獲得的碎片離子見表4。

表4 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺分子式及質譜參數(shù)

圖7 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物質譜圖

由于溴有2種穩(wěn)定同位素：Br-79(50.69%)和Br-79(49.31%)，占比相似，特征性很強。因此，在同一碎片離子間存在m/z為2的差距，且該碎片具有近乎一致的相對豐度值。其中149作為鄰苯二甲酸酯的特性離子，鄰苯二甲酸酯存在廣譜污染性，經(jīng)常存在于實驗室溶劑中；108作為丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物共有的碎片離子，且作為碳13標記的內標物質與目標物出峰時間相同；136作為柱流失的特征離子，會造成高溫段的基線升高，影響靈敏度，因此在選擇離子時應盡量避開這3個碎片離子。

2.5 方法學評價

2.5.1 線性范圍、檢出限及定量限

以AM濃度作為橫坐標、AM與13C3-AM峰面積的比值作為縱坐標，采用最小二乘法進行回歸分析，得到濃度在0.0100～1.00 μg/mL丙烯酰胺的線性擬合方程Y=8.3466X+0.0762(Y為丙烯酰胺峰面積與內標13C3-丙烯酰胺的比值，X為丙烯酰胺的質量濃度)，相關系數(shù)R2為0.9999。以3倍信噪比確定方法檢出限(LOD)為0.4 μg/kg，以10倍信噪比確定方法定量限(LOQ)為1.3 μg/kg。

2.5.2 精密度和回收率

選取2種不同丙烯酰胺含量的紅糖進行精密度和回收率實驗。對低濃度丙烯酰胺含量的紅糖樣品，分別選取25，50，100 μg/kg低、中、高3個水平進行6個平行加標回收實驗；對高濃度丙烯酰胺含量的紅糖樣品，分別選取200，400，800 μg/kg低中高3個水平進行6個平行加標回收實驗，得到相應的回收率和相對標準偏差見表5。

表5 不同紅糖樣品中AM添加測定

2.6 實際樣品測定

分別對云南、廣西、廣東、江蘇4個國內主要的紅糖生產地區(qū)在售的3種不同紅糖，以及從2個國家進口的紅糖，共14批次樣品進行丙烯酰胺含量檢測，檢測結果見圖8。顯然，紅糖中丙烯酰胺的含量跨度較大，從25～960 μg/kg不等，多分布在500 μg/kg附近，其中2個有機紅糖丙烯酰胺含量較低，分別為25.4 μg/kg和30.2 μg/kg。

圖8 紅糖樣品中丙烯酰胺含量

3 結論

本文通過DB-Heavywax毛細管柱分離，建立了使用單四極桿質譜儀選擇離子監(jiān)控模式檢測紅糖中丙烯酰胺含量的方法。采用單因素實驗與響應面實驗，確定溴化反應的最佳條件為10%濃硫酸加入量為8 mL，反應溫度為4 ℃，反應時間為40 min，并選擇以乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18作為吸附劑填料對溴化反應后樣品進行凈化。該方法操作簡單，具有較高的回收率和較好的重復性，能夠滿足紅糖中丙烯酰胺含量的測定要求，符合日常監(jiān)督和檢測要求，為紅糖類食品的質量監(jiān)管提供了技術支持。