孫天利，程楚怡，楊涔，張晗，王虹玲

(沈陽工學院 生命工程學院，遼寧 撫順 113122)

山芹菜，別名山芹、大葉芹，是一種遍布在中國北方地區(qū)的蔬菜，主要生長于遼寧、吉林、黑龍江等地的雜木林中或闊葉林下[1]。山芹菜營養(yǎng)價值較高，含有脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種維生素等[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，山芹菜中的維生素C含量高出西芹5倍以上，胡蘿卜素含量高出西芹38倍，維生素B2含量是十字花科植物大白菜和甘藍的2倍以上[6]。另外，山芹菜中還富含多種微量元素，其中鐵元素含量是一些常見蔬菜的10～30倍，對預(yù)防缺鐵性貧血有一定的作用[7-9]。

金翠香梨是由雪花梨和莊河1號梨雜交選育而成的遼寧優(yōu)良梨品種，果實均重200～400 g，最大的接近700 g[10-11]。金翠香梨香氣濃郁，脆而多汁，果肉細膩，石細胞少，可溶性固形物含量達15%～18%[12-15]。金翠香梨富含纖維素、果糖等物質(zhì)，易被人體吸收利用，且有潤腸通便的作用[16-19]。另外，金翠香梨還具有一定的護肝、減緩疲勞、提高心肌活力等功效[20-24]。

山芹菜和金翠香梨都是東北地區(qū)的特產(chǎn)果蔬，分布廣泛，產(chǎn)量高，但山芹菜常用于烹飪，金翠香梨則主要以鮮食為主，二者相關(guān)的深加工產(chǎn)品相對較少，經(jīng)濟價值較低。醋在我國有著上千年的歷史，而混合果醋也是果品深加工的一個主流方向，即采用多種果蔬為原料，通過釀造制成醋類產(chǎn)品?；旌瞎准婢叽缀投喾N水果的風味，并且含有機酸、醇類、酯類、酚類等多種營養(yǎng)成分[25-30]。以山芹菜和金翠香梨為原料釀制的果醋營養(yǎng)豐富，口味獨特，同時深加工極大地提高了兩種原料的附加值，為山區(qū)特色食品的加工提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

山芹菜、金翠香梨：市售；釀酒活性干酵母、蔗糖：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：山東濟寧祥園生物科技有限公司；檸檬酸：河南碩之隆實業(yè)有限公司；果膠酶(30000 U/g)：山東隆科特酶制劑有限公司。

1.2 試劑

氫氧化鈉(分析純)：天津富宇精細化工有限公司；碳酸鈣、硫酸銅(均為分析純)：天津市致遠化學試劑有限公司；殼聚糖：山東隆科特酶制劑有限公司；焦亞硫酸鉀：山東中天生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

WZ-108型糖度計 浙江托普儀器有限公司；WBL2501B型榨汁機 美的集團有限公司；1645#型滴定管 泰州市環(huán)儀玻璃儀器有限公司；XLSC-100型酒精計 北京中西遠大科技有限公司；FA2240型分析天平 常州幸運電子設(shè)備有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴箱 常州國華電器有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精密試驗設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 工藝流程

1.4.2 操作要點

1.4.2.1 山芹菜預(yù)處理

挑選新鮮且無病蟲害的山芹菜，清洗干凈后，于95 ℃的0.005 mol/L氫氧化鈉溶液中燙漂3 min，然后在硫酸銅溶液中浸泡6 h，再將浸泡后的山芹菜在清水中流動沖洗10 min，最后以10%的比例加水榨汁并過濾。

1.4.2.2 金翠香梨預(yù)處理

選擇品相良好、無病蟲害的梨果，洗凈后去皮去核，在500 mL蒸餾水中加入3 g檸檬酸，將預(yù)處理好的梨果放入加有檸檬酸的蒸餾水中浸泡5 min進行護色處理，然后對梨果進行榨汁，隨后加入0.4%果膠酶酶解1 h后進行過濾。

1.4.2.3 混合調(diào)配、殺菌

將金翠香梨汁和山芹菜汁按比例混合后，在75 ℃下殺菌30 s，最后冷卻降溫。

1.4.2.4 酒精發(fā)酵

稱量0.5%的酵母菌加入到2%的蔗糖溶液中，并在35 ℃下恒溫水浴活化酵母菌20 min。將活化好的酵母菌溶液搖勻后依次加入到山芹菜和金翠香梨混合汁中，然后在30 ℃下恒溫發(fā)酵10 d，得到山芹菜金翠香梨果酒。

1.4.2.5 醋酸發(fā)酵

將醋酸菌加入到山芹菜金翠香梨果酒中，在30 ℃下不斷攪拌，直到絕大部分的醋酸菌完全溶解，再將攪拌好的果酒放入溫度20～40 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min的水浴鍋中進行發(fā)酵，每日測定總酸含量。

1.4.2.6 澄清、殺菌、成品

在100 mL混合型果醋中添加濃度為1%的殼聚糖0.5 mL，并靜置1.5 h，以達到澄清作用。將澄清后的山芹菜金翠香梨混合果醋于82 ℃下水浴20 min，然后迅速冷卻至4～5 ℃，無菌灌裝后即得山芹菜金翠香梨混合果醋成品。

1.4.3 單因素試驗

以醋酸菌添加量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L)、發(fā)酵溫度(20，25，30，35，40 ℃)、果蔬汁配比(梨汁∶山芹菜汁分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、發(fā)酵時間(4，6，8，10，12 d)為主要因素，以酸度為評價指標，進行單因素試驗，確定最優(yōu)的單因素發(fā)酵條件。

1.4.4 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇醋酸菌添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、果蔬汁配比(C)和發(fā)酵時間(D)4個因素，以山芹菜金翠香梨混合果醋的總酸含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗條件優(yōu)化響應(yīng)面設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.4.5 理化指標測定

按照響應(yīng)面法優(yōu)化的釀造工藝進行山芹菜金翠香梨混合果醋的釀造，并對所釀造的果醋進行理化指標測定。

1.4.5.1 總酸含量的測定

參照GB/T 12456-2008中的酸度法(以乙酸計)。

1.4.5.2 菌落總數(shù)和大腸桿菌的測定

分別參照國標GB 4789.2-2016和GB 4789.3-2016中的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 山芹菜金翠香梨混合果醋發(fā)酵的單因素試驗

2.1.1 醋酸菌添加量對醋酸發(fā)酵的影響

由圖1可知，總酸含量隨著醋酸菌添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當醋酸菌添加量達到0.4 g/L時，總酸含量達到最大值。隨著醋酸菌添加量的增加，發(fā)酵越來越充分，產(chǎn)酸量逐漸增加。醋酸菌含量繼續(xù)增加，總酸含量則呈現(xiàn)下降的趨勢，分析認為，添加過量的醋酸菌使醋酸菌對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭激烈，不利于醋酸菌的生長繁殖，從而影響產(chǎn)酸量。因此，選擇0.4 g/L為醋酸菌最適添加量。

圖1 醋酸菌添加量對醋酸發(fā)酵的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

分別設(shè)定發(fā)酵溫度為20，25，30，35，40 ℃，研究不同發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響，對總酸含量進行測定并記錄，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

由圖2可知，在山芹菜金翠香梨混合果醋的釀造過程中，發(fā)酵溫度對混合果醋品質(zhì)影響較大，總酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。起初，隨著發(fā)酵溫度的升高，微生物活性逐漸增強，發(fā)酵產(chǎn)酸能力也增強，當溫度達到30 ℃時，產(chǎn)酸量達到最大值；當溫度超過30 ℃后，過高的溫度反而使微生物活性受到抑制，甚至失活，發(fā)酵產(chǎn)酸能力下降。溫度超過醋酸菌發(fā)酵的最適溫度，使菌種活力降低，發(fā)酵能力降低。所以，選擇30 ℃為最適發(fā)酵溫度。

2.1.3 果蔬汁配比對醋酸發(fā)酵的影響

將梨汁與山芹菜汁按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的比例混合，研究果蔬汁不同配比對醋酸發(fā)酵的影響，對總酸含量進行測定并記錄，結(jié)果見圖3。

圖3 果蔬汁配比對醋酸發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著梨汁與山芹菜汁配比的增大，發(fā)酵產(chǎn)酸量逐漸升高，當配比為4∶1時，總酸含量達到最大值。配比中梨汁的含量越高，則發(fā)酵所能利用的碳源越足，發(fā)酵越充分。當梨汁與山芹菜汁配比為5∶1時，發(fā)酵總酸含量降低，分析認為，混合果蔬汁中含糖量過高，滲透壓過大，反而抑制了菌種的活性，不利于發(fā)酵的進行。所以，果蔬汁的最佳配比為4∶1。

2.1.4 發(fā)酵時間對醋酸發(fā)酵的影響

分別設(shè)定復合果醋的發(fā)酵時間為4，6，8，10，12 d，對總酸含量進行測定并記錄，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對醋酸發(fā)酵的影響

由圖4可知，在山芹菜金翠香梨復合果醋的釀造過程中，隨著時間的延長，醋酸菌發(fā)酵越來越充分，總酸含量逐漸升高，在第10天達到最大值。第10天后，總酸含量小幅降低，分析認為是少量醋酸揮發(fā)所致。所以，最佳發(fā)酵時間為10 d。

2.2 混合果醋生產(chǎn)工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10.0.3進行多元回歸分析。以醋酸菌添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、果蔬汁配比(C)和發(fā)酵時間(D)為主要因素，以總酸含量作為響應(yīng)值，其分析方案與評分結(jié)果見表2，針對表2中的數(shù)據(jù)得到回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

Y=6.02+0.037A+0.023B-0.014C+0.023D+0.008AB-0.065AC+0.038AD-0.018BC-0.045BD+0.04CD-0.11A2-0.032B2-0.064C2-0.12D2。

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，山芹菜金翠香梨混合果醋的總酸含量變化的回歸模型變量關(guān)系極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，說明選用的二次多項模型的擬合程度良好。試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.9690，校正系數(shù)RAdj2=0.9380，表明回歸方程相關(guān)性較好。變量A、B、D和交互項AC、AD、BD、CD以及各二次項對總酸含量的影響極顯著(P<0.01)，變量C對總酸含量的影響顯著(P<0.05)。影響山芹菜金翠香梨混合果醋總酸含量的排序為：果蔬汁配比(C)<發(fā)酵時間(D)<發(fā)酵溫度(B)<醋酸菌添加量(A)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

各因素間的交互作用對果醋總酸含量的影響見圖5～圖8。

圖5 醋酸菌添加量與果蔬汁配比的交互作用對總酸含量的響應(yīng)面

圖6 醋酸菌添加量與發(fā)酵時間的交互作用對總酸含量的響應(yīng)面

圖7 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的交互作用對總酸含量的響應(yīng)面

圖8 果蔬汁配比與發(fā)酵時間的交互作用對總酸含量的響應(yīng)面

由圖5～圖8可知，A醋酸菌添加量與C果蔬汁配比、A醋酸菌添加量與D發(fā)酵時間、B發(fā)酵溫度與D發(fā)酵時間、C果蔬汁配比與D發(fā)酵時間交互作用的三維圖較陡，曲面變化較為明顯，說明這幾組因素的交互作用對果醋總酸含量的影響較大。

2.2.3 驗證試驗

通過響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果分析，當醋酸菌添加量為0.43 g/L、發(fā)酵溫度為32.41 ℃、果蔬汁配比為3.68∶1、發(fā)酵時間為9.99 d時，總酸含量為6.04 g/dL，響應(yīng)值達到理論最大值。為了使試驗操作更簡易可行，將最佳條件修改為醋酸菌添加量0.4 g/L、發(fā)酵溫度32 ℃、果蔬汁配比4∶1、發(fā)酵時間10 d；為保證試驗結(jié)果準確，進行3次驗證試驗，3次試驗得到的果醋品質(zhì)極佳，實際測量的總酸含量與響應(yīng)面試驗結(jié)果接近，平均總酸含量為5.97 g/dL，此試驗值與理論值基本一致，因此本試驗的模型擬合度高，數(shù)據(jù)真實可靠，可以作為山芹菜金翠香梨混合果醋釀造工藝的數(shù)據(jù)，以此為準進行混合果醋的生產(chǎn)加工。

2.3 微生物指標測定

以最佳試驗條件釀造山芹菜金翠香梨混合果醋，并參照國家標準測定其微生物指標。結(jié)果顯示，果醋的菌落總數(shù)≤100 CFU/mL，未檢出大腸菌群和致病菌，產(chǎn)品微生物指標符合國家標準。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法確定了山芹菜金翠香梨混合果醋釀造的最佳工藝條件：醋酸菌添加量0.4 g/L、發(fā)酵溫度32 ℃、果蔬汁配比4∶1、發(fā)酵時間10 d。在此工藝條件下得到的山芹菜金翠香梨混合果醋的總酸含量為5.97 g/dL，果醋色澤為淡棕色，醋體澄清透亮，醋香濃郁，風味獨特，微生物指標符合國家標準。