王瑩瑩，汪學(xué)德，王東營，苗紅梅

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，鄭州 450002；3.河南省特色油料作物基因組學(xué)重點實驗室(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心)，鄭州 450002)

辣椒(CapsicumannumL.)，又名牛角椒，為茄科辣椒屬草本類植物，原產(chǎn)于中南美洲[1]，在明朝時期引入我國，現(xiàn)大量種植于我國新疆、云南、貴州等地[2]。目前，我國已經(jīng)成為世界最大的辣椒生產(chǎn)國、出口國、消費國[3]。辣椒油樹脂(capsicum oleoresin)又稱辣椒精、辣椒精油，通常是用有機(jī)溶劑索氏抽提后經(jīng)真空濃縮得到的深紅色黏稠狀的液體，氣味辛辣，流動性較小，不溶于水，易溶于丙酮、正己烷、石油醚等有機(jī)溶劑[4]。辣椒油樹脂中含有辣椒色素類物質(zhì)(如辣椒紅色素、辣椒黃素、辣椒玉紅素等)，以及大量的辣椒堿類物質(zhì)(如高辣椒堿、二氫辣椒堿)[5]。辣椒堿是辣椒油樹脂中的辛辣物質(zhì)，用來提供辣味[6]。辣椒油樹脂可應(yīng)用于食品行業(yè)與精細(xì)化工領(lǐng)域。在食品中，辣椒油樹脂主要用于生產(chǎn)日用調(diào)味料(如火鍋底料、辣椒油等)以及腌制、調(diào)理食品中。辣椒油樹脂也可進(jìn)一步用于提取辣椒紅色素與辣椒堿等精細(xì)化工產(chǎn)品。

截至目前，學(xué)者們對于辣椒油樹脂的研究多集中于對其提取與純化工藝的優(yōu)化。在辣椒油樹脂組成成分方面，劉佳等[7]以海南黃燈籠辣椒為原料，優(yōu)化了超臨界CO2法提取辣椒油樹脂的工藝條件，并運用GC-MS對樹脂的化學(xué)成分進(jìn)行了分析。在辣椒油樹脂抑菌及抗氧化活性方面，范三紅等[8]以市售干紅辣椒為原料，采用超聲輔助法提取了辣椒油樹脂，并以瓊脂打孔法和自由基清除試驗研究樹脂的抑菌效果和抗氧化能力。然而，在辣椒油樹脂化學(xué)成分及其表現(xiàn)出的抗氧化活性關(guān)聯(lián)方面研究報道較少。

因此，為進(jìn)一步探明辣椒油樹脂的化學(xué)成分與抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)，本文以貴州干紅辣椒為原料，提取了辣椒油樹脂，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析了辣椒油樹脂中的揮發(fā)性化學(xué)成分，并對其抗氧化活性進(jìn)行了探究。該研究為辣椒油樹脂的高效利用提供了理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

干紅辣椒(貴州條椒)：購于淘寶商城線上超市。

1.2 試劑

鹽酸、三氯化鐵、甲醇(均為分析純)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)：美國Sigma公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ)、2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate),ABTS)：阿拉丁試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-6000PC紫外可見光分光光度計 上海元析儀器有限公司；KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療器械有限公司；DVB-CAR-PDMS手動固相微萃取(SPME)進(jìn)樣器 美國Sigma公司；7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 辣椒油樹脂提取及揮發(fā)性成分分析

選用鮮干紅辣椒，去蒂除籽后，采用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。稱取80 g辣椒粉末，以丙酮為提取溶劑，進(jìn)行索氏抽提，將提取液減壓蒸餾，得到的暗紅色黏稠狀液體即為辣椒油樹脂。

1.4.1.1 萃取方法

將3 g辣椒油樹脂置于20 mL頂空瓶中，放入50 ℃水浴中平衡30 min；頂空萃取20 min，在氣相色譜儀進(jìn)樣口熱解吸5 min；隨后進(jìn)行GC-MS分析。

1.4.1.2 色譜條件

色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)和VF-WAX MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：起始溫度40 ℃，在40 ℃條件下保持3.5 min，以4 ℃/min的速率升溫到230 ℃，保持8 min；以10 ℃/min 的速率升溫至280 ℃，保持5 min。四級桿溫度為150 ℃；載氣為高純氦氣，流速為1.8 mL/min。

1.4.1.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源，電子能量 70 eV，傳輸線溫度 280 ℃，離子源溫度 230 ℃，四級桿溫度 150 ℃，質(zhì)量掃描范圍(m/z)30～500，全掃描采集模式。

1.4.1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Agilent MSD化學(xué)工作站，將辣椒油樹脂揮發(fā)性成分的GC-MS譜圖與Agilent NIST 17質(zhì)譜庫進(jìn)行比對。根據(jù)匹配度(≥80)和保留指數(shù)定性，并利用面積歸一化法計算每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對百分含量。

1.4.2 辣椒油樹脂抗氧化活性測試

1.4.2.1 DPPH自由基清除率測定

參照Ma等[9]的方法并稍加改動，測定DPPH自由基清除率。將辣椒油樹脂與甲醇溶液混合，配制成不同濃度的辣椒油樹脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)。隨后，將0.5 mL不同濃度的辣椒油樹脂溶液與3 mL 0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液混合均勻后避光反應(yīng)30 min。采用分光光度計在517 nm處測定吸光度值(Asample)。甲醇溶液作為背景(Abackground)，以去除辣椒油樹脂本身顏色對吸光度值的干擾。空白組為一級水(Ablank)，陽性對照為抗壞血酸(VC，100 μg/mL)。按下式計算DPPH·清除率：

DPPH·清除率(%)=[1-(Asample-Abackground)/Ablank]×100。

1.4.2.2 ABTS+自由基清除率測定

參考Pang等[10]的方法并稍加改動，測定ABTS自由基清除率。將ABTS與磷酸緩沖鹽(PBS)溶液混合配制成7 mmol/L ABTS母液。將10 mL ABTS母液與178 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，避光反應(yīng)12～16 h，即為ABTS儲備液。

測定時，用PBS溶液稀釋ABTS儲備液，使ABTS反應(yīng)液的吸光度在0.7±0.05。溶液配制完成后，將0.1 mL不同濃度的辣椒油樹脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)與3.9 mL ABTS反應(yīng)液混合，避光條件下反應(yīng)10 min。使用分光光度計測量混合液在734 nm處的吸光度。一級水作為空白(Ablank)，抗壞血酸(VC，100 μg/mL)作為陽性對照。按下式計算ABTS+·清除率：

ABTS+·清除率(%)=(1-Asample/Ablank)×100。

1.4.2.3 總還原能力測定

參照Srivastava等[11]的方法并稍加改動，測定總還原力。吸取1 mL不同濃度的辣椒油樹脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)，依次加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和1 mL 1%鐵氰化鉀溶液(K3[Fe(CN)6])，劇烈搖晃，使其混合均勻。50 ℃條件下水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸，3500 r/min離心10 min。取上清液1.5 mL，依次加入1.5 mL一級水和0.15 mL 0.1%的FeCl3，繼續(xù)反應(yīng)10 min。采用分光光度計在700 nm處測定吸光度值，以抗壞血酸(VC，100 μg/mL)作為陽性對照。吸光度值表明還原能力的大小。

1.4.2.4 總抗氧化能力測定

根據(jù)Xu等[12]的方法測定鐵離子還原能力(Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)。將FeCl3·6H2O(20 mmol/L)、TPTZ(10 mmol/L)和HCl(40 mmol/L)與乙酸鹽的緩沖液(300 mmol/L，pH 3.6)按照1∶1∶10的比例混合來制備FRAP反應(yīng)液。首先將FRAP反應(yīng)液加熱至37 ℃，然后將0.1 mL不同濃度的辣椒油樹脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)與3 mL FRAP工作液和0.3 mL一級水混合，混合液反應(yīng)4 min。使用分光光度計測量混合液在593 nm處的吸光度值。以抗壞血酸(VC，100 μg/mL)為陽性對照。根據(jù)上述方法，用Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.9959)。精確計算FRAP值，校準(zhǔn)曲線為每升該濃度辣椒油樹脂樣品的毫摩爾Fe2+當(dāng)量。

1.4.2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016記錄和分析試驗數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。

如圖5所示，基于流體力學(xué)理論，采用有限元方法，建立二維幾何模型來模擬毫秒激光對鋁板的打孔過程。為簡化計算過程，對模型提出如下假設(shè)：1) 將計算中涉及的流體作為不可壓縮牛頓流體處理；2) 將金屬蒸氣作為理想氣體處理，且對于入射的激光無影響；3) 鋁液的沸點不受其他因素影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒油樹脂揮發(fā)性化學(xué)成分分析

為明確辣椒油樹脂中的揮發(fā)性化學(xué)成分，對提取所得辣椒油樹脂進(jìn)行了HS-SPME-GC-MS分析。通過Agilent MSD化學(xué)工作站，將辣椒油樹脂揮發(fā)性成分的GC-MS 譜圖與Agilent NIST 17標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜庫進(jìn)行比對鑒定，根據(jù)匹配度(≥80)和保留指數(shù)定性，并利用面積歸一化法計算每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對百分含量。結(jié)果顯示，從貴州條椒樣本中鑒定出了47種化合物，見表1。分別包括15種烷烴類化合物、13種萜烯類化合物、9種酯類化合物、5種醛類化合物、3種醇類化合物，以及2種呋喃類化合物。

表1 辣椒油樹脂化學(xué)成分及相對含量表

2.2 辣椒油樹脂體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率

DPPH基團(tuán)具有單電子，是以氮為中心的一種穩(wěn)定自由基，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收[13]?？寡趸瘎┛墒贵w系褪色，從而減小吸光度值。因此DPPH·清除率可通過吸光度值的變化進(jìn)行分析。

用不同濃度的辣椒油樹脂溶液對DPPH·清除率進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 辣椒油樹脂清除DPPH·能力

由圖1可知，隨著辣椒油樹脂濃度的增大(0.6～3.0 mg/mL)，辣椒油樹脂對DPPH·的清除率逐步提升。當(dāng)辣椒油樹脂濃度為0.6 mg/mL時，對DPPH·的清除率為21.1%。當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mg/mL時，對DPPH·的清除率達(dá)到了78.0%，并接近VC的作用效果(清除率為94.8%)。

2.2.2 ABTS自由基清除率

ABTS是測定親脂性和親水性物質(zhì)抗氧化能力的一種間接方法，氧化后生成的藍(lán)綠色ABTS+·可溶于水相及醇溶液中，在734 nm處有最大吸收峰[14]。樣品中的抗氧化成分可與ABTS+·反應(yīng)而使體系褪色，因此可根據(jù)吸光度值的變化計算出ABTS+·自由基清除率。

用不同濃度的辣椒油樹脂溶液對ABTS+·清除率進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 辣椒油樹脂清除ABTS+ ·能力

由圖2可知，辣椒油樹脂清除ABTS+·的能力隨著濃度的升高而升高，在濃度為1.8 mg/mL時辣椒油樹脂對ABTS+·的清除率為39.8%，超過了VC對該自由基的清除率(39.4%)；在濃度為3.0 mg/mL時辣椒油樹脂對ABTS+·的清除率可達(dá)67.9%。

2.2.3 總還原力測定

還原力是以普魯士藍(lán)(Fe4[Fe(CN)6]3)的生成量為指標(biāo)，樣品中的抗氧化成分將Fe3+還原為Fe2+，再與FeCl3反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在700 nm處有最大吸收峰[15]。因此，樣品還原力可通過吸光度值的變化進(jìn)行分析。

對不同濃度辣椒油樹脂的總還原力進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 辣椒油樹脂總還原力

由圖3可知，辣椒油樹脂總還原能力隨著濃度的升高而升高，在濃度為0.6 mg/mL時，辣椒油樹脂顯示出的還原能力較低，為0.30。當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mg/mL時，辣椒油樹脂的還原力為0.81。與對照VC相比，辣椒油樹脂的還原能力相對較差。

2.2.4 總抗氧化能力測定

FRAP(Ferric ion reducing antioxidant power)是一種在低pH條件下利用Fe2+與TPTZ生成藍(lán)紫色復(fù)合物(在593 nm處有強(qiáng)吸收)來測定樣品抗氧化能力的方法，廣泛運用于食品的抗氧化能力分析[16]。

首先建立Fe2+溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.9536X-0.0686，R2=0.9959)，用于精確計算FRAP值。隨后，檢測不同濃度辣椒油樹脂溶液的總抗氧化能力，見圖4。

圖4 辣椒油樹脂總抗氧化能力

由圖4可知，辣椒油樹脂總抗氧化能力隨著濃度的增大而升高，在濃度為1.8 mg/mL時，F(xiàn)RAP值為0.51 mmol/L，已高于VC的總抗氧化能力(0.46 mmol/L)；在濃度為3.0 mg/mL時辣椒油樹脂的FRAP值為0.77 mmol/L。

3 結(jié)論

本研究鑒定出了辣椒油樹脂中47種揮發(fā)性化學(xué)成分，其主要化學(xué)成分(相對含量高于1.0%)為：甲基戊酮醇(27.56%)、苯乙醛(15.05%)、糠醛(8.89%)、香橙烯(6.75%)、茴香腦(5.89%)、苯甲醛(5.48%)、γ-丁內(nèi)酯(4.55%)、2-甲基十三烷(3.20%)、檸檬烯(2.57%)、月桂烯(2.05%)、癸烷(1.87%)、2-甲基四癸烷(1.26%)、(E)-β-羅勒烯(1.22%)、(2S,3S)-2,3-丁二醇(1.16%)、十一烷(1.10%)、2-甲基-1-十四碳烯(1.10%)共16種物質(zhì)，占揮發(fā)性成分總量的89.70%。同時，在體外抗氧化活性測試中確定了辣椒油樹脂具有良好的自由基清除能力、總還原能力及總抗氧化能力。

4 討論

本文在貴州條椒的辣椒油樹脂中檢測出了47種揮發(fā)性化學(xué)成分，包括烷烴類、萜烯類、酯類、醛類、醇類以及呋喃類化合物。其主要組成成分及相對含量與已報道的樣本存在一定的差異。例如：李洪福等[17]采用GC-MS分析了海南黃燈籠辣椒提取物的化學(xué)成分，結(jié)果表明辣椒提取物的成分為脂肪酸類、酰胺類、烷烴類、甾醇類以及維生素類化合物。紀(jì)良霞等[18]采用GC-MS對廣西指天椒的乙酸乙酯提取物進(jìn)行了成分分析，其主要組成成分為脂肪酸類、辣椒堿類、酯類、醇類以及呋喃類化合物。劉艷敏等[19]采用HS-SPME-GC-MS對貴州油辣椒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，其主要組成成分為萜烯類、醛類、酯類、醇類、酮類、烷烴類、呋喃類、吡嗪類、吡咯類和芳香烴類化合物。本試驗從辣椒油樹脂中鑒定出的相對含量最高的2種化合物為甲基戊酮醇(27.56%)、苯乙醛(15.05%)，屬于醛類和醇類化合物，這可能與所選用的辣椒樣本、辣椒油樹脂提取方法及成分分析方法有關(guān)。下一步將增加樣本基因型，并對提取方法和分析方法進(jìn)行比對，以進(jìn)一步明確影響辣椒油樹脂主要組成成分的因素。

此外，體外抗氧化測試結(jié)果證實了辣椒油樹脂具備良好的抗氧化活性，該結(jié)果與以往其他類似研究結(jié)果較為相似。Tepe等[20]研究發(fā)現(xiàn)含有單萜化合物或者倍半萜的精油一般可表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。Ruberto等[21]研究認(rèn)為單萜烯類化合物表現(xiàn)出的抗氧化活性源自其中含有活潑的亞甲基基團(tuán)，如α-蒎烯、檸檬烯、γ-松油烯、茴香烯等。本文中辣椒油樹脂化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，單萜類物質(zhì)在辣椒油樹脂中的含量較高，該類物質(zhì)對自由基具有良好的清除作用，因此，辣椒油樹脂表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。相比于抗壞血酸(VC)，辣椒油樹脂的自由基清除活性與還原力要低一些，這可能與辣椒油樹脂的純度不夠有關(guān)。但是抗壞血酸作為一種強(qiáng)抗氧化劑，天然提取物抗氧化能力存在遜色于抗壞血酸的情況，這在周江菊等[22]對樗葉花椒葉精油的抗氧化活性測定中也有體現(xiàn)。

今后將對辣椒油樹脂化學(xué)成分與抗氧化能力之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)一步開展研究，為揭示辣椒風(fēng)味油脂的氧化穩(wěn)定性及其風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。