田 晶 隋海娟 陳 月 （錦州醫(yī)科大學，錦州 121000）

流感病毒（influenza virus，IV）是呼吸道感染的重要病原體，由于變異快，尤其是動物源流感病毒在人群中的高致死率和廣泛流行性已引起全世界高度關注［1］。固有免疫系統(tǒng)是抵抗流感病毒入侵的第一道防線，感染早期快速的固有細胞免疫應答能有效控制呼吸道上皮細胞感染及流感病毒復制［2］。巨噬細胞作為固有免疫系統(tǒng)重要的專職吞噬細胞，通過內(nèi)化方式和溶酶體降解過程清除感染顆粒，以攝取凋亡細胞的形式去除病毒感染的細胞碎片［3］。此外，巨噬細胞M1 型（經(jīng)典激活型）分泌TNF-α 和NOS 等炎癥因子，幫助機體清除流感病毒。M2 型（替代激活型）具有抗炎功能，釋放多種抗炎遞質(zhì)，參與組織修復［4-5］。巨噬細胞的雙向調(diào)節(jié)作用對流感病毒免疫應答的平衡發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠巨噬細胞株RAW264.7（SCSP-5036）購于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑 甲型流感病毒鼠肺適應株A/PR/8/34（H1N1，PR8）由國家疾病預防控制中心流感所饋贈；RNeasy Mini Kit 試劑盒購自德國QIAGEN；One Step SYBR?Prime ScriptTMRT-PCR Kit購自日本TaKaRa公司；TLR4、NF-κB和Influenza NP 抗體購自美國 Abcam 公司；Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/WashTMBuffer 購自美國BD 公司；細胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白、TPCK-胰酶和HEPES緩沖液購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 流感病毒PR8 雞胚培養(yǎng) 用1 ml 注射器吸取200 μl 流感病毒PR8 接種于8~11 日齡的雞胚尿囊腔，用無菌醫(yī)用膠布將裂口封好。36 ℃孵育2~3 d，將雞胚置于?20 ℃1 h即可無菌收集尿囊液。1 200 g離心15 min 去除沉淀。取少量用于病毒滴度檢測，其余1.5 ml/管分裝于2 ml凍存管，?80 ℃保存。

1.2.2 紅細胞凝集試驗（HA）檢測病毒滴度 取生理鹽水至96孔U型板第2~12列（50μl/孔）。加入病毒液50μl于U型板第1、2列對應孔。混勻第2列孔中的病毒液和生理鹽水，吸出50μl至第3列，混勻，依次倍比稀釋。第 12 列棄去 50 μl，50 μl/孔加入1%豚鼠血紅細胞懸液混勻，室溫靜置30 min，觀察凝集現(xiàn)象。以凝集的最高稀釋倍數(shù)為終點，其倒數(shù)即為病毒滴度。

1.2.3 流感病毒TCID50檢測 RAW264.7 細胞以2×104個/孔接種于 96 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h，病毒半對數(shù)稀釋法：96孔板第1列豎向4孔146μl/孔加入100 倍稀釋的病毒液，其他各列100μl/孔加入病毒維持液。從第1孔吸46μl至第2孔，混勻，再吸46 μl 至第 3 孔，連續(xù)進行半對數(shù)稀釋（10?2~10?6.5）；Hank's 液清洗細胞，將已稀釋的病毒液加至96 孔RAW264.7 細胞板對應孔，各稀釋度設4 個復孔，35 ℃ 1 h；Hank's 清洗，200 μl/孔加入病毒維持液（TPCK-胰酶2 μg/ml）35 ℃培養(yǎng)，觀察細胞病變。根據(jù) Reed 和Muench 法計算病毒滴度（TCID50/50 μl）。距離比例=（>50%的陽性%?50）（/>50%的陽性%?<50%的陽性%）；TCID50對數(shù)=最高稀釋對數(shù)（>50%的陽性%）+稀釋系數(shù)對數(shù)×距離比例。

1.2.4 細胞分組 實驗分為對照組、100 TCID50組和1 000 TCID50組。對照組：細胞生長液。100 TCID50組：100 TCID50流感病毒 PR8 吸附 1 h，Hank's 液清洗，加入病毒維持液。1 000 TCID50組：1 000 TCID50流感病毒PR8 吸附1 h，Hank's 液清洗，加入病毒維持液，細胞感染48 h時進行各指標檢測。

1.2.5 Hoechst 染色 將細胞爬片置于24 孔板，接種 RAW264.7 細胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h。100 TCID50組和 1 000 TCID50組棄孔中液體，Hank's 清洗2 遍，分別用 100 TCID50和 1 000 TCID50的病毒 PR8稀釋液感染細胞 1 h，Hank's 清洗 2 遍，500 μl/孔加入病毒維持液，48 h 后吸盡液體，Hank's、PBS 清洗2 次（500 μl/孔），固定液固定 10 min，PBS 清洗 3 次（500 μl/孔），加入Hoechst 33258 染色液染色5 min（500 μl/孔），PBS 清洗3 次（500 μl/孔），取出爬片，滴加25μl抗熒光淬滅封片液于爬片細胞面，蓋于潔凈玻片上，熒光顯微鏡下觀察細胞核。

1.2.6 細胞熒光染色 細胞爬片及TCID50感染同1.2.5。4%多聚甲醛固定15 min（1 ml/孔），PBS 清洗 3 次，TLR4 直接染色，Influenza NP 和 NF-κB 透膜：0.5%TritonX-100（1 ml/孔）20 min，PBS 清洗 3 次（500 μl/孔），2%BSA 封閉30 min，加入1∶100稀釋的一抗 Influenza NP、TLR4 和 NF-κB p65（200 μl/孔）4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次（500μl/孔），加入 1∶1 000稀釋的FITC 標記的二抗（200 μl/孔）室溫避光孵育1 h，PBS 清洗3 次（500 μl/孔），取出爬片，滴加25 μl含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 流式細胞術檢測RAW264.7 細胞凋亡RAW264.7 細胞接種于低黏附6 孔板，感染PR8 48 h 收集細胞，制備單細胞懸液：胰酶消化后轉至15 ml 離心管，800 g 離心5 min，棄上清，加入500 μl Binding Buffer 重懸細胞。細胞染色：加入Annexin V-FITC 5 μl 和7-AAD 3 μl，過300 目尼龍篩網(wǎng)至BD流式管，避光5~15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.8 RT-PCR 檢測各指標mRNA 水平 提取細胞總RNA，參照QIAGEN RNeasy mini kit 試劑盒說明書。引物由TaKaRa 公司合成（表1）。反應體系：SYBR RT-PCR Buffer 10 μl、EX TaqHS（5 U/μl）0.4 μl、PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 μl、PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μl、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μl、ROX Reference Dye（50×）0.4 μl、Total RNA 1 μl。反應條件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s繪制熔解曲線。2?ΔΔCt計算相對表達。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.9 流式細胞術檢測RAW264.7 細胞Influenza NP、TLR4 和 NF-κB p65 表達 收集各組細胞，PBS清洗，加入1∶100 稀釋的 TLR4，PBS 清洗，于細胞沉淀中加入 100 μl Fixation/Permeabilization solution，混勻，4 ℃避光 20 min，1 ml/管加入 Buffer，1 200 g 離心 3 min。棄上清，加入 Influenza NP/NF-κB p65（1∶100）室溫避光 1 h。加入1 ml/管 Buffer，1 200 g離心3 min，棄上清，加入DyLight488 標記的二抗（1∶1 000）室溫避光 30 min，1 ml/管加入 Buffer，混勻，離心3 min，棄上清，300 μl/管加入Buffer，過300目尼龍篩網(wǎng)至BD流式細胞管，流式細胞術檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0 和GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析、LSD 檢驗和Spearman 相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雞胚培養(yǎng)PR8 的滴度 HA 結果顯示，流感病毒PR8 經(jīng)雞胚分離培養(yǎng)后，病毒滴度由培養(yǎng)前的1∶32提高到1∶512（圖1）。

圖1 雞胚培養(yǎng)流感病毒后的病毒滴度Fig.1 Virus titer after influenza virus culture in chicken embryo

2.2 流感病毒TCID50病毒組織細胞TCID50是病毒感染能力的標化指標，根據(jù)Reed 和Muench 對HA進行計算，100 TCID50/50 μl=1∶28.2（圖2、表2）。

表2 Reed-Muench 計算TCID50 滴度的病毒稀釋度配比情況Tab.2 Virus dilution ratio of TCID50 by Reed-Muench method

圖2 流感病毒TCID50（HA實驗）Fig.2 TCID50 of influenza virus（HA test）

2.3 細胞形態(tài)學改變 倒置顯微鏡下觀察對照組RAW264.7 細胞多呈圓形、類圓形，透亮狀。感染10 TCID50PR8后，少量細胞呈長梭形改變，100 TCID50組細胞呈長梭形并出現(xiàn)偽足，胞內(nèi)可見空泡和顆粒狀物質(zhì)，1 000 TCID50組細胞向不規(guī)則多形態(tài)轉變，少量細胞破裂（圖3）。Hoechst 染色可見對照組細胞的細胞核呈暗藍色，10 TCID50組少量細胞的細胞核出現(xiàn)點狀濃染，100 TCID50組細胞有少量細胞的細胞核呈碎塊狀致密濃染，1 000 TCID50組出現(xiàn)少量凋亡細胞，細胞核致密濃染或呈碎塊狀濃染，呈亮藍色。100 TCID50組和1 000 TCID50組細胞凋亡率均高于 10 TCID50組（P<0.05），1 000 TCID50組細胞凋亡率高于100 TCID50組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖4）。

圖3 光鏡下RAW264.7細胞形態(tài)Fig.3 Light microscope morphology of RAW264.7 cells

圖4 RAW264.7細胞Hoechst染色Fig.4 Hoechst staining of RAW264.7 cells

2.4 RAW264.7 細胞凋亡情況 RAW264.7 細胞感染流感病毒PR8 48 h 時，100 TCID50組和1 000 TCID50組RAW264.7 細胞凋亡率均有不同程度升高（P<0.01）。100 TCID50組主要發(fā)生細胞早期凋亡，100 TCID50組細胞晚期凋亡增多，1 000 TCID50組較100 TCID50組細胞凋亡率小幅提高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與10 TCID50組比較，100 TCID50組和1 000 TCID50組細胞凋亡率顯著提高（P<0.01，圖5）。

圖5 RAW264.7細胞凋亡流式圖Fig.5 Flow cytometric diagram of apoptosis of RAW264.7 cells

2.5 RAW264.7細胞內(nèi)病毒增殖情況 qPCR 結果表明，RAW264.7 細胞感染PR8 48 h 后病毒mRNA顯著升高，10 TCID50組提高 2.2×104倍（P<0.05），100 TCID50組提高9.1×104倍（P<0.01），1 000 TCID50組12.3×104倍（P<0.01），1 000 TCID50組感染水平較100 TCID50組呈上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與 10 TCID50組比較，100 TCID50組和1 000 TCID50組病毒mRNA 表達顯著增加（P<0.01，圖6）。流式分析結果表明，RAW264.7細胞感染不同病毒載量PR8后胞內(nèi)Influenza NP水平升高（P<0.05）。與 10 TCID50組比較，100 TCID50組和 1 000 TCID50組NP 表達顯著增加（P<0.01），1 000 TCID50組較100 TCID50組NP表達小幅增加（P>0.05，圖7）。

圖6 RAW264.7細胞病毒相對表達Fig.6 Relative expression of virus in RAW264.7 cells

圖7 FCM檢測RAW264.7細胞NP表達Fig.7 NP expression in RAW264.7 cells detected by FCM

細胞免疫熒光染色對細胞蛋白表達定位可見，Influenza NP 主要表達于細胞核，正常對照組不表達Influenza NP 蛋白。流感病毒PR8 感染48 h 時，100 TCID50組和 1 000 TCID50組 Influenza NP 表達明顯增強（圖8）。

2.6 RAW264.7 細胞 Toll 樣受體及 NF-κB p65 水平 qPCR 結果表明，RAW264.7 細胞感染PR8 48 h后TLR4 和 NF-κB p65 mRNA 水平升高（P<0.05），且1 000 TCID50組上升幅度明顯高于100 TCID50組（P<0.01）。與 10 TCID50組比較，100 TCID50組和1 000 TCID50組mRNA 水平不同程度升高（P<0.05，圖8）。流式分析結果表明，RAW264.7 細胞感染PR8 后胞內(nèi) TLR4 和 NF-κB p65 平均熒光強度增強（P<0.01），1 000 TCID50組強度高于 100 TCID50組（P<0.01）。與 10 TCID50組比較，100 TCID50組和1 000 TCID50組熒光強度不同程度升高（P<0.05，圖9）。細胞免疫熒光染色對細胞蛋白表達定位可見，TLR4 蛋白主要表達于細胞膜，NF-κB p65 蛋白主要表達于細胞核。正常對照組少量表達TLR4 和NF-κB p65 蛋 白 ，PR8 感 染 48 h 時 10 TCID50組RAW264.7 細胞 TLR4 和 NF-κB p65 蛋白表達小范圍增加。100 TCID50組和1 000 TCID50組蛋白表達增強，且1 000 TCID50組增高幅度強于100 TCID50組（圖10）。

圖8 RAW264.7細胞NP蛋白表達Fig.8 Protein expression of NP in RAW264.7 cells

圖9 FCM檢測RAW264.7細胞TLR4和NF-κB p65表達Fig.9 Expressions of TLR4 and NF-κB p65 in RAW264.7 cells detected by FCM

圖10 RAW264.7細胞TLR4和NF-κB p65蛋白表達Fig.10 Protein expressions of TLR4 and NF-κB p65 in RAW264.7 cells

2.7 RAW264.7細胞炎癥因子水平 qPCR和ELISA結果顯示，與對照組比較，10 TCID50組、100 TCID50組和1 000 TCID50組細胞IL-6、TNF-α和IFN-β mRNA水平和培養(yǎng)液各因子濃度均明顯上升（P<0.05），且1 000 TCID50組上升幅度顯著高于100 TCID50組（P<0.01）。與 10 TCID50組比較，100 TCID50組和1 000 TCID50組各因子mRNA 水平不同程度升高（P<0.05，圖11）。

圖11 RAW264.7細胞IL-6、TNF-α和IFN-β水平Fig.11 Levels of IL-6，TNF-α and IFN-β in RAW264.7 cells

2.8 RAW264.7 細胞感染劑量與各指標相關性分析 RAW264.7 細胞 感染 10 TCID50、100 TCID50和1 000 TCID50不同病毒載量PR8，感染劑量與細胞凋亡率（FCM）和胞內(nèi)NP（FCM）、TLR4（FCM）、NF-κB p65（FCM）、IL-6、TNF-α 和 IFN-β（qPCR）水平呈正相 關（r=0.634，P=0.002；r=0.747，P<0.001；r=0.812，P<0.001；r=0.790，P<0.001；r=0.805，P<0.001；r=0.874，P<0.001；r=0.863，P<0.001）。

3 討論

流感病毒感染后引起細胞膜改變、細胞損傷及死亡、炎癥反應和組織免疫病理損傷，誘導一系列抗病毒免疫應答，非特異性免疫系統(tǒng)是抵御病原入侵的第一道防線［6］。單核-吞噬細胞系統(tǒng)是抗病毒免疫的重要因素，包括血循環(huán)中的單核細胞及組織中的巨噬細胞［7］。流感病毒感染后，巨噬細胞遷移至感染部位，加工處理提呈抗原，并釋放大量活性遞質(zhì)發(fā)揮殺傷功能［8-9］。國內(nèi)外研究多集中于生物制劑/化學物質(zhì)活化巨噬細胞發(fā)揮抗病毒作用，但不同劑量病毒感染對巨噬細胞免疫指標的差異性影響罕見報道［10-16］。本文以 10 TCID50、100 TCID50和1 000 TCID50低、中、高劑量H1N1 型流感病毒感染RAW264.7細胞，比較巨噬細胞感染狀態(tài)、凋亡率和炎癥因子相關通路指標，初步探討固有免疫細胞抗病毒的作用機制。

本研究顯示RAW264.7細胞感染PR8后胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和顆粒狀物質(zhì)，100 TCID50組和1 000 TCID50組細胞核均有不同程度亮藍色碎塊狀致密濃染，且細胞凋亡率顯著高于10 TCID50組。RAW264.7 細胞感染 PR8 48 h 后病毒 mRNA 和 Influenza NP 顯著升高，100 TCID50組和 1 000 TCID50病毒 mRNA 和 NP表達均高于10 TCID50組。提示RAW264.7 細胞感染不同病毒載量PR8 后細胞感染狀態(tài)和凋亡率存在顯著差異。Spearman 相關分析證實RAW264.7細胞感染低、中、高病毒載量PR8 后，感染劑量與細胞凋亡率和胞內(nèi)NP水平呈正相關，RAW264.7細胞感染率存在劑量依賴性。

進一步對巨噬細胞表面Toll樣識別受體和核轉錄因子 NF-κB p65 的研究發(fā)現(xiàn)，RAW264.7 細胞感染PR8 48 h 后TLR4 和NF-κB p65 mRNA、平均熒光強度和蛋白水平均顯著升高，隨感染劑量的增高呈上升趨勢。流感病毒入侵巨噬細胞后其表面識別受體TLR4 高表達，識別病毒RNA，通過刺激MyD88和TRAF，最終激活NF-κB 信號通路，促進炎癥因子的分泌。RAW264.7 細胞感染病毒后，IL-6、TNF-α和IFN-β mRNA 水平和培養(yǎng)液各因子濃度均顯著上升，100 TCID50組和1 000 TCID50組各因子水平較比10 TCID50組有不同程度升高，且1 000 TCID50組各指標顯著高于100 TCID50組。提示RAW264.7 細胞感染低、中、高病毒載量PR8后TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α 和 IFN-β 水平差異顯著。Spearman 相關分析證實RAW264.7 細胞感染低、中、高不同病毒載量PR8，感染劑量與 TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α 和IFN-β 水平呈正相關，RAW264.7 細胞抗病毒狀態(tài)有劑量依賴性。由此可見，高劑量病毒感染誘導巨噬細胞通過Toll-NF-κB 通路活化，產(chǎn)生高水平炎癥因子以清除病毒，致使細胞抗病毒狀態(tài)維持較高水平，最終導致高劑量1 000 TCID50組病毒增殖和細胞凋亡率較比100 TCID50組僅有小幅度升高，而無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，巨噬細胞RAW264.7 通過上調(diào)TLR4-NF-κB 信號通路誘導下游炎癥因子表達發(fā)揮抗病毒增殖效應，且感染劑量與巨噬細胞抗病毒狀態(tài)呈正相關。