江思思，劉俊偉，陸 旸

(1. 天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2. 天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

與其他常見的呼吸道傳播病原體相比，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的潛伏期更長、傳染性更強，早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早隔離仍然是疫情防控的關鍵[1-2]．現(xiàn)在以具有高特異性、高靈敏度等特點的核酸檢測作為新型冠狀病毒的主要檢測手段[3]，但由于RNA不太穩(wěn)定，容易降解，所以對樣品的采集、運輸及提取要求很高；另外，還存在檢測時間長、實驗條件依賴度高等問題．就檢測時間而言，僅PCR溫度改變的過程就需要2h，加上樣本處理的時間，整個檢測過程需幾小時甚至更長時間．就實驗條件而言，核酸檢測需要專用的PCR儀和專業(yè)實驗人員，并且要在安全等級至少為2級的生物安全實驗室進行檢測[4]．

酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是免疫學與酶學相結(jié)合的免疫分析方法．抗原與抗體特異性結(jié)合，并在酶的高效催化下，使該方法具有較高的特異性和靈敏度．同時，ELISA實驗操作簡單，實驗要求不高，可在普通實驗室內(nèi)檢測，2h內(nèi)出檢測結(jié)果，在食品安全、臨床醫(yī)學、微生物及病毒檢測等多個領域被廣泛運用[4-6]. 免疫層析技術(shù)(lateral flow assay，LFA)，又稱為側(cè)向?qū)恿骷夹g(shù)，是一種以毛細作用為驅(qū)動力的快速檢測方 法[7-8]. 其中以納米材料膠體金作為免疫標記的免疫層析法操作簡單，具有耗時短、價格低廉、結(jié)果穩(wěn)定等特點，可在10～15min內(nèi)出結(jié)果，易于進行商品化和標準化，常用于快速診斷和現(xiàn)場檢測，是LFA中運用最廣泛的方法[9-10]．相較于核酸檢測，以免疫學為基礎的ELISA和LFA檢測方法具有檢測時間短、操作步驟簡單和實驗要求低等特點，逐漸成為一種重要的檢測手段[4].

SARS-CoV-2是正鏈RNA冠狀病毒，有4種結(jié)構(gòu)蛋白[11-12]，其中核衣殼蛋白(N蛋白)因高度保守且有良好的免疫原性，常用于檢測新型冠狀病毒的單克隆抗體制備[13-14]．因此，本文將N蛋白作為抗原制備出特異性高的單克隆抗體并建立了間接競爭ELISA法和膠體金免疫層析試紙條法，用于快速檢測SARS-CoV-2的N蛋白．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與細胞

含有新型冠狀病毒重組N蛋白基因序列的大腸桿菌(E. coli)BL21(DE3)菌株，天津國際生物醫(yī)藥研究院；雌性Balb/c免疫小鼠，天津市奧易德實驗用品有限公司；SP2/0骨髓瘤細胞，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司．

1.1.2 試劑與儀器

二甲基亞砜，德國Merck公司；脫脂乳粉，美國BD公司；牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、檸檬酸、β-糊精、過氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、三羥甲基氨基甲烷(THAM)、聚乙二醇(PEG，50%)、PEG 200、PEG 20000、氯金酸、檸檬酸三鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，美國Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG酶標二抗(羊抗鼠二抗)、酶標稀釋液，美國Promega公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT選擇性培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基，美國Gibco公司；卡那霉素、IPTG誘導劑、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、咪唑、石蠟油、紅細胞裂解液，北京索萊寶生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，北京酷來博科技有限公司；Triton X-100，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化學試劑均為分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司．

超聲波破碎細胞機，上海秉越電子儀器有限公司；親和層析鎳柱，北京索萊寶生物科技有限公司；酶標儀、紫外分光光度計、CO2細胞培養(yǎng)箱、－80℃冰箱、細胞培養(yǎng)板、25cm2細胞培養(yǎng)瓶，美國Thermo公司；冷凍離心機，德國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；雙維往復劃膜儀、微電腦自動斬切機，上海金標生物科技有限公司；型號為CN140和CN95的硝酸纖維素(NC)膜，德國Sartorious公司；型號為HF180的NC膜，美國Millipore公司；型號為NC90的NC膜，美國Pall公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 重組抗原N蛋白的表達與純化

將大腸桿菌BL21(DE3)進行平板劃線培養(yǎng)， 37℃培養(yǎng)過夜獲得單克隆菌落．將單克隆菌落移至800mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴大培養(yǎng)．在菌液中加入800μL 1mmol/L IPTG誘導劑，16℃繼續(xù)培養(yǎng)18h進行蛋白質(zhì)的表達；表達完成后將菌液離心并收集菌落，用緩沖液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油，pH 7.5)將沉淀懸浮，-20℃保存．

用超聲破碎機將已表達的菌體破碎至澄清透明并離心，將離心后的上清液加到已平衡好的鎳柱中，4℃振蕩結(jié)合4～5h．用洗脫液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油、100mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脫雜質(zhì)蛋白，用洗脫液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油、500mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脫目的蛋白．將目的蛋白轉(zhuǎn)移到超濾管中，加入一定量0.01mol/L PBS緩沖液，離心超濾60min進行換液濃縮；收集上層液體，即為N蛋白．用BCA試劑盒測定N蛋白的質(zhì)量濃度并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗，用Image J對凝膠圖進行灰色度分析，計算其純度．

1.2.2 N蛋白單克隆抗體的制備

選用精神狀態(tài)良好、生長正常的10周齡Balb/c雌性小鼠5只，將上述純化的重組N蛋白作為免疫抗原，用0.9%生理鹽水進行稀釋后，與佐劑等體積混合，充分乳化后對小鼠進行腹腔注射免疫．每次免疫間隔兩周，共免疫4次，用間接ELISA法測定小鼠免疫血清的效價．選擇效價最高的小鼠進行沖刺免疫，3d后取其脾細胞，在PEG200的作用下與骨髓瘤細胞進行細胞融合．用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，選出450nm處吸光度(A450)最高的雜交瘤細胞株制備單克隆抗體．本文采用正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法對小鼠腹水進行純化．

1.2.3 間接競爭ELISA法

用0.05mol/L碳酸鉀溶液稀釋N蛋白后加到酶標板中，每孔100μL，4℃過夜；棄孔中液體，用0.01mol/L PBST洗板3次后，每孔加入含0.5%脫脂乳粉的封閉液200μL，37℃孵育1h進行封閉，洗板3次；每孔加入樣品溶液50μL、N蛋白單克隆抗體50μL，37℃孵育1h，洗板4次；加入已稀釋10000倍的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育30min，洗板5次；加入底物液，每孔100μL，顯色，37℃反應15～30min；加入終止液，每孔50μL，終止顯色，利用酶標儀測定A450．按照式(1)計算小鼠抗體的抑制率，并繪制抑制曲線．

式中：A對照為加50μL抗體和50μL PBS緩沖液的A450，A測定為加50μL抗體和50μL N蛋白的A450，A空白為加100μL PBS緩沖液的A450．

對N蛋白包被量、抗體稀釋倍數(shù)、稀釋液pH及封閉條件進行優(yōu)化，用最優(yōu)條件參數(shù)進行實驗，建立標準曲線．

1.2.4 膠體金免疫層析試紙條法

通過檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，將膠體金與N蛋白單克隆抗體相連制備金標抗體，以此作為試紙條實驗的探針．將羊抗鼠二抗和N蛋白分別作為質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)包被在NC膜上，37℃烘干后組裝并切割試紙條．將適量的金標探針與100μL 0.01mol/L PBS緩沖液混勻后滴到樣品墊上，10min后觀察結(jié)果．膠體金免疫層析試紙條法采用競爭法檢測新型冠狀病毒N蛋白，樣品中的新型冠狀病毒N蛋白與T線上的N蛋白競爭金標抗體，導致T線上的顏色與樣品中N蛋白濃度成反比．

對實驗條件中的羊抗鼠二抗和N蛋白的稀釋倍數(shù)、NC膜種類、碳酸鉀溶液和抗體的添加量、上樣緩沖液的種類及pH進行優(yōu)化，用最優(yōu)條件參數(shù)進行試紙條實驗，確定可視檢測限(vLOD)和臨界值．

2 結(jié)果與討論

2.1 重組抗原N蛋白的鑒定

超濾后N蛋白的(SDS-PAGE)電泳分析圖如圖1所示．

圖1 超濾后N蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of N protein after ultrafiltration

超濾后蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為4.7×104，已知新型冠狀病毒N蛋白含有419個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為4.74×104[15]，由此可以確定成功制備出N蛋白．用Image J對凝膠圖進行灰色度分析，計算出N蛋白的純度為90%左右，用BCA試劑盒測定其質(zhì)量濃度為0.5mg/mL．

2.2 N蛋白單克隆抗體的制備

2.2.1 小鼠免疫血清效價的測定

三免和四免后1周，對5只小鼠采血并測定其免疫血清的效價，結(jié)果見表1．

表1 三免和四免后免疫血清效價的測定結(jié)果 Tab. 1 Results of immune serum titer after the third and fourth immunization

由表1可知：每只小鼠在免疫后，其免疫血清效價都提高了，其中1號小鼠在四免后免疫血清的效價最高，為1﹕5.12×105，故選用1號小鼠進行細胞 融合實驗．

2.2.2 細胞融合及篩選

將免疫血清效價最高的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合并經(jīng)過3次篩選，選出3株效價最高的細胞株1F5、2B3和2G3進行兩次亞克隆，結(jié)果見表2．由表2可知：2G3兩次亞克隆的陽性比率都低于50%，不能穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體，而1F5和2B3這兩株細胞株，兩次亞克隆的陽性比率都高于90%，故選取這兩株細胞所克隆的并且效價最高的單克隆細胞株(編號分別為1F57A6G、2B39F2B)進行后續(xù)擴大培養(yǎng)并制備單克隆抗體．

表2 篩選細胞的兩次亞克隆結(jié)果 Tab. 2 Results of two subclones of screened cells

2.2.3 單克隆抗體效價的測定

以每孔1μg的N蛋白包被量，用質(zhì)量濃度均為8mg/mL的2B39F2B和1F57A6G兩種單克隆抗體通過間接ELISA法測定其效價，結(jié)果見表3．當A450為0.8～1.2時，2B39F2B對應的效價為1﹕1.024×106，比1F57A6G的效價(1﹕5.12×105)更高，說明2B39F2B中特異性抗體的濃度更高，故選用2B39F2B用于后續(xù)的實驗．

表3 純化后單克隆抗體效價的測定結(jié)果 Tab. 3 Determination results of titer of purified monoclonal antibody

2.3 間接競爭ELISA法的建立

2.3.1 N蛋白包被量及抗體稀釋倍數(shù)的確定

分別選取6個不同的孔包被量0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg，再分別選取9個不同的N蛋白單克隆抗體稀釋倍數(shù)7.5×104、1.5×105、3×105、5×105、1×106、2×106、4×106、7×106、1×107，采用棋盤法組合不同包被量和抗體稀釋倍數(shù)．用間接ELISA法測定其A450，選擇A450在1.0附近的組合并通過標準曲線計算IC50．包被量及抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表4．當包被量由每孔0.1μg升至每孔0.5μg時，抗體稀釋倍數(shù)和IC50逐漸增大，這可能是由于包被過量形成多層抗原吸附，在操作過程中抗原可能會發(fā)生脫落而降低了靈敏度．當包被量由每孔0.1μg降至每孔0.01μg時，抗體稀釋倍數(shù)逐漸降低，IC50卻逐漸增大，這可能是由于包被量太低導致顯色不穩(wěn)定．當包被量為每孔0.1μg時，顯色較為穩(wěn)定，且IC50最低，因此選擇每孔0.1μg的包被量和1﹕2×106的抗體稀釋倍數(shù)為最佳優(yōu)化條件．

表4 包被量及抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果 Tab. 4 Optimization results of coating amount and antibody dilution ratio

2.3.2 封閉液的優(yōu)化

封閉液的作用是封閉酶標板上未被蛋白質(zhì)包被的孔，減少實驗誤差．選取質(zhì)量分數(shù)分別為0.5%和1%的脫脂乳粉和BSA制備封閉液進行實驗，結(jié)果見表5．

表5 封閉液優(yōu)化結(jié)果 Tab. 5 Optimization results of blocking buffer

由表5可知：脫脂乳粉對應的IC50都低于BSA對應的IC50，表明脫脂乳粉的封閉效果優(yōu)于BSA．通常由于BSA中只有單一的蛋白質(zhì)，抗體與之結(jié)合發(fā)生交叉反應的概率很低；而脫脂乳粉有更多種類的蛋白質(zhì)，且存在脫脂不完全的可能，未完全去除的脂質(zhì)會影響蛋白質(zhì)與酶標板底孔的結(jié)合，進而影響封閉效果．然而，實驗中脫脂乳粉的封閉效果優(yōu)于BSA，其可能原因：一是因為所購買的脫脂乳粉脫脂完全；二是N蛋白單克隆抗體特異性很好，不會與脫脂乳粉發(fā)生交叉反應；三是脫脂乳粉中含有更多種類的非特異性蛋白，具有更好的封閉作用．0.5%脫脂乳粉對應的IC50為24.60μg/L，低于1.0%脫脂乳粉所對應的IC50(31.08μg/L)．這可能是因為封閉液濃度過高，在一定程度上會阻擋抗原的結(jié)合表位，影響抗體與抗原的結(jié)合，導致靈敏度降低，故選擇0.5%脫脂乳粉為最佳封閉條件．

2.3.3 稀釋液pH的優(yōu)化

選取pH為5.7、7.4和8.5的PBS進行間接競爭 ELISA實驗，稀釋液pH優(yōu)化結(jié)果見表6．結(jié)果表明：當稀釋液pH為酸性或堿性時，其IC50都比pH為中性時高，檢測的靈敏度下降．其原因可能是酸/堿條件抑制了蛋白質(zhì)的活性或使其發(fā)生變性，影響抗體捕獲抗原的靈敏度以及酶促反應的效果[16]，故選稀釋液pH7.4為最佳實驗條件．

表6 稀釋液pH優(yōu)化結(jié)果 Tab. 6 Optimization results of pH of solution

2.3.4 N蛋白間接競爭ELISA標準曲線的繪制

通過上述實驗的優(yōu)化后，用N蛋白單克隆抗體建立的間接競爭ELISA法最佳條件為：包被量為每孔0.1μg，抗體稀釋2×106倍，用0.5%脫脂乳粉制備封閉液，酶標稀釋液二抗稀釋2×105倍，用pH 7.4的PBS緩沖液稀釋抗體和標準品．在最優(yōu)條件下進行間接競爭ELISA實驗，繪制其標準曲線如圖2所示，該方法的靈敏度IC50為(22.16±1.77)μg/L，檢測限IC15為(0.31±0.75)μg/L．

圖2 N蛋白間接競爭ELISA標準曲線 Fig. 2 Standard curve of N protein by indirect competitive ELISA

2.4 膠體金免疫層析試紙條法的建立

2.4.1 膠體金的制備

通過檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，溶液呈酒紅色，均勻透亮，無沉淀和雜質(zhì)．用酶標儀設置紫外分光波長400～600nm掃描膠體金溶液的吸收峰，其最高吸收峰對應波長為519nm(圖3)，參考文獻[17]制備出的膠體金顆粒直徑約為17nm．

圖3 膠體金紫外分光掃描波長圖譜 Fig. 3 UV scanning wavelength spectrum of colloidal gold

2.4.2 羊抗鼠二抗和N蛋白稀釋倍數(shù)的選擇

將羊抗鼠二抗和N蛋白用PBS緩沖液分別稀釋一定倍數(shù)后劃在NC膜上，進行免疫層析實驗，結(jié)果見表7．

表7 羊抗鼠二抗和N蛋白稀釋倍數(shù)的選擇 Tab. 7 Optimization of goat anti-mouse secondary antibody and N protein dilution ratio

當羊抗鼠二抗和N蛋白的稀釋倍數(shù)分別大于20和10時，出線顏色太淺；當羊抗鼠二抗和N蛋白的稀釋倍數(shù)分別小于20和10時，出線顏色過深；當羊抗鼠二抗和N蛋白分別稀釋20倍和10倍時，出線顏色基本一致且適中．因此，選擇羊抗鼠二抗稀釋20倍、N蛋白稀釋10倍作為最佳稀釋條件．

2.4.3 NC膜的優(yōu)化

選Sartorious公司型號CN140和型號CN95、Millipore 公司型號HF180和Pall公司型號NC90 的NC膜分別組裝成試紙條進行實驗，結(jié)果如圖4 所示．

圖4 NC膜的優(yōu)化 Fig. 4 Optimization of different NC membrane

由圖4可知：NC90和HF180對應的C線顏色深于T線，且HF180有背景干擾，使顯色不清晰；CN140和CN95對應的C線與T線顏色基本一致，但CN95的背景更干凈，顯色更清晰，故選擇CN95型號的NC膜作為最佳實驗條件．

2.4.4 碳酸鉀溶液添加量的優(yōu)化

酸堿度對膠體金與抗體的標記至關重要，添加不同量的K2CO3溶液可以調(diào)節(jié)膠體金與抗體結(jié)合過程的pH，結(jié)果如圖5所示．當K2CO3溶液添加量大于5μL時，C線、T線顏色逐漸變淺，這可能是因為此時溶液的pH高于抗體的等電點，使抗體與膠體金之間的電荷發(fā)生排斥而限制兩者的吸附．當K2CO3溶液添加量小于5μL時，C線略淺于T線，這可能是因為此時溶液的pH低于抗體的等電點，使膠體金發(fā)生凝集作用[18]. 當K2CO3溶液添加量為5μL時，C線、T線顏色基本一致且清晰，這是因為此時溶液的pH呈中性，使抗體與膠體金顆粒之間的靜電作用最小、疏水作用較大，抗體能充分與膠體金顆粒穩(wěn)定結(jié)合. 故選5μL作為K2CO3溶液最佳添加量．

圖5 碳酸鉀溶液添加量的優(yōu)化 Fig. 5 Optimization of different volume of K2CO3 solution

2.4.5 抗體添加量的優(yōu)化

在K2CO3溶液添加5μL條件下，添加不同量的N蛋白單克隆抗體與膠體金結(jié)合，結(jié)果如圖6所示．當抗體添加量為1μL時，C線、T線顏色很淺，這是因為抗體添加量過少，膠體金與抗體未充分結(jié)合．當抗體添加量大于3μL時，C線與T線顏色基本一致，且不再發(fā)生變化，這說明當抗體添加量為3μL時，膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合已經(jīng)處于飽和狀態(tài)．考慮到添加過多的抗體會降低方法的靈敏度并提高成本，抗體最佳添加量選擇3μL．

圖6 抗體添加量優(yōu)化 Fig. 6 Optimization of different volume of antibody

2.4.6 上樣緩沖液種類的優(yōu)化

不同的緩沖液影響金標抗體與C線、T線的反應，進而影響C線、T線出線顏色．選取100μL pH為7.4的PB、PBS、PBST、BB作為上樣緩沖溶液，與金標抗體混勻后按照上述已優(yōu)化的實驗條件進行試紙條實驗，結(jié)果如圖7所示．當緩沖液為PB和BB時，C線、T線顏色較淺；當緩沖液為PBST時， C線略淺于T線；當緩沖液為PBS時，C線、T線顏色基本一致且顏色適中，故選擇PBS為最佳緩沖液種類．

圖7 上樣緩沖液種類的優(yōu)化 Fig. 7 Optimization of different solution buffer

2.4.7 上樣緩沖液pH的優(yōu)化

將最優(yōu)上樣緩沖液的pH調(diào)節(jié)為5.7、7.4和8.5，與金標抗體混勻后按照上述已優(yōu)化的實驗條件進行試紙條實驗，結(jié)果如圖8所示．當pH為5.7時，C線略淺于T線；當pH為8.5時，C線略深于T線；當pH為7.4時，C線、T線顏色基本相同．這可能是因為過酸或過堿的環(huán)境都會影響蛋白質(zhì)的活性，使蛋白質(zhì)之間不能有效結(jié)合，當pH為6～8時更有利于蛋白質(zhì)的結(jié)合[16]，故選擇pH為7.4的上樣緩沖液作為最佳條件．

圖8 上樣緩沖液pH的優(yōu)化 Fig. 8 Optimization of different pH of PBS buffer

2.4.8 膠體金免疫層析試紙條檢測限的確定

取100μL上樣緩沖液將N蛋白溶液稀釋為31、62、125、250、500、1000μg/L，與探針混合后按照上述已優(yōu)化的實驗條件進行實驗，結(jié)果如圖9所示．

圖9 膠體金免疫層析試紙條檢測限的確定 Fig. 9 Detection limit of colloidal gold-labeled immunochromatographic test strips

當待測N蛋白質(zhì)量濃度為500μg/L時，T線完全消失，故本方法的臨界值為500μg/L；當待測N蛋白質(zhì)量濃度為62μg/L時，T線比C線略淺一點．故本方法的可視檢測限為62μg/L．

3 結(jié) 論

本研究以新型冠狀病毒抗原為檢測目標物建立了兩種免疫檢測方法．間接競爭ELISA法的最優(yōu)條件為：N蛋白包被量為每孔0.1μg，單克隆抗體稀釋2×106倍，用0.5%脫脂乳粉制備封閉液，酶標稀釋液二抗稀釋2×105倍．在pH 7.4環(huán)境下，該方法的靈敏度IC50為(22.16±1.77)μg/L，檢測限 IC15為 (0.31±0.75)μg/L．膠體金免疫層析試紙條法的最優(yōu)條件為：羊抗鼠二抗稀釋20倍，N蛋白稀釋10倍，用Sartorious公司CN95型號的NC膜，單克隆抗體添加量為3μL，碳酸鉀溶液添加量為5μL，pH 7.4的PBS緩沖液作為上樣緩沖液．該方法可視檢測限(vLOD)為62μg/L，臨界值為500μg/L，可在10min左右測出結(jié)果．兩種免疫學方法對SARS-CoV-2的N蛋白進行快速檢測，可作為核酸檢測的重要輔助手段.