張聰子，張金玲，杜光，王維武，姜瓊，夏松柏，陳輝，甘露珍，徐金軍，章登政，傅勃，饒志威

(1.咸寧市中心醫(yī)院、湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，咸寧 437100；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，長(zhǎng)沙 410000)

復(fù)方肺毒清顆粒由防風(fēng)、炒白術(shù)、魚腥草、赤芍、柴胡、桔梗、浙貝母、冬桑葉、川桂枝、炒白芍、板藍(lán)根、生甘草等12味中藥組成，具有辛溫解表、清熱解毒、宣肺止咳功效。方中柴胡作為君藥，有祛風(fēng)清肺、抵御疫毒之功。2020年初新型冠狀病毒肺炎(簡(jiǎn)稱新冠肺炎)疫情暴發(fā)后，該方經(jīng)湖北省咸寧市新冠肺炎疫情防控指揮部醫(yī)療專家組討論通過(guò)，在咸寧地區(qū)推薦使用。在咸寧市中心醫(yī)院確診的117例患者中，服用103例，使用率88.03%；在咸寧市第一人民醫(yī)院確診的223例患者中，服用200例，使用率89.69%；嘉魚縣醫(yī)療機(jī)構(gòu)初期確診的患者中有127例使用，治愈41例，治愈率32.28%，且無(wú)死亡病例；同時(shí)在中醫(yī)防治新冠肺炎中具有較高使用頻次，在抗擊新冠肺炎疫情中發(fā)揮了積極作用[1-3]。臨床應(yīng)用過(guò)程中，由于中藥復(fù)方合劑多采用傳統(tǒng)煎煮方式給藥，患者用藥依從性差。因此，本實(shí)驗(yàn)將該方制備成復(fù)方肺毒清顆粒，并進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1試藥 防風(fēng)(批號(hào)：190601)、炒白術(shù)(批號(hào)：201001)、魚腥草(批號(hào)：200701)、赤芍(批號(hào)：191201)、柴胡(批號(hào)：191201)、桔梗(批號(hào)：200701)、浙貝母(批號(hào)：191201)、冬桑葉(批號(hào)：200101)、川桂枝(批號(hào)：200101)、炒白芍(批號(hào)：191201)、板藍(lán)根(批號(hào)：190501)、生甘草(批號(hào)：201001)均購(gòu)自安徽省亳州市坤源醫(yī)藥有限公司，藥材經(jīng)咸寧市中心醫(yī)院主管中藥師孟婷鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部規(guī)定。

糊精(安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：200308)、甜菊糖(安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：200308)、柴胡皂苷a(含量：94.80%，批號(hào)：110777-201912，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙腈(批號(hào)：202889)、甲醇(批號(hào)：203074)為色譜級(jí)，均購(gòu)自美國(guó)Fisher chemical公司。

1.2儀器 Thermo UltiMate3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)；DSH-50-1電子水分測(cè)定儀(上海奧平科學(xué)儀器制造有限公司)；ZP-200振蕩器(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；TDL-60B低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；GLTQ-50L多功能提取濃縮罐(上海格翎環(huán)境科技有限公司)；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；YOKO-BD薄層電動(dòng)點(diǎn)樣儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)；ZY-600U薄層色譜自動(dòng)成像分析系統(tǒng)(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1復(fù)方肺毒清顆粒的制備 處方組成為：防風(fēng)、炒白術(shù)、魚腥草、赤芍、柴胡、浙貝母、冬桑葉、川桂枝、炒白芍、板藍(lán)根各10 g，桔梗5 g，生甘草6 g，總劑量111 g，水煎服(加水量為藥材量的5.4倍)，每日2劑，早晚各1次。

稱取處方量各藥材飲片，分別加入一定量水，置多功能提取器內(nèi)，采用水回流提取法提取3次，得到含固率為29.3 %的干膏，粉碎，備用。將干浸膏、糊精、甜菊糖按照一定比例混合，制粒，干燥，整粒。本成品檢驗(yàn)合格后制成單包裝顆粒，每袋裝量10 g，貼標(biāo)簽。

2.2顆粒評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1成型率的計(jì)算 將制備好的顆粒稱質(zhì)量，先過(guò)篩孔內(nèi)徑2.00 mm(一號(hào))篩，再過(guò)篩孔內(nèi)徑0.18 mm(五號(hào))篩，收集能通過(guò)篩孔內(nèi)徑2.00 mm篩，但不能通過(guò)篩孔內(nèi)徑0.18 mm的顆粒，稱質(zhì)量，計(jì)算成型率。

2.2.2溶化率的測(cè)定 在干燥至恒質(zhì)量的10 mL離心管中加入精密稱量的顆粒，加入沸水5 mL，持續(xù)攪拌5 min，3000 r·min-1離心15 min(離心半徑r=13 cm)，棄上清液，將殘?jiān)?0 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算溶化率。

2.2.3休止角的測(cè)定 采用固定漏斗法，將漏斗固定于水平放置的坐標(biāo)紙上高1.5 cm的位置(H)，緩慢將顆粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中，直到形成的顆粒圓錐尖端接觸到漏斗口為止，測(cè)算圓錐底部的直徑(2R)，計(jì)算休止角tgα=H/R。成型性、溶化率、休止角的權(quán)重系數(shù)各設(shè)為45%，30%，25%，綜合評(píng)分=45%×(成型率/最大成型率)+30%×(溶化率/最大溶化率)+25%×(最小休止角/休止角)[4]。

2.2.4堆密度的測(cè)定 取本品顆粒適量，沿壁緩慢加入干燥至恒質(zhì)量的10 mL量筒中，待顆粒表面至10 mL刻度處，稱質(zhì)量，減去干燥空量筒質(zhì)量即為顆粒的質(zhì)量，平行測(cè)定3次，計(jì)算堆密度。堆密度ρ=顆粒質(zhì)量/容積×100%。

2.2.5吸濕性的測(cè)定 配制氯化鈉飽和溶液，置于玻璃干燥器中，25 ℃恒溫平衡48 h。精密稱定本品顆粒2 g，平行3份，置于干燥至恒質(zhì)量的稱量瓶中，于24，48，72，96，120，144，168 h后稱質(zhì)量，計(jì)算吸濕百分率。吸濕率越低顆粒越不容易吸潮，質(zhì)量也越穩(wěn)定[5-6]。吸濕百分率=(吸濕后顆粒質(zhì)量-吸濕前顆粒質(zhì)量)/吸濕前顆粒質(zhì)量×100%。

2.2.6水分測(cè)定 采用水分測(cè)定儀平行測(cè)定3次。

2.3處方篩選

2.3.1藥物與輔料比例考察 稱取干浸膏粉20.3 g 3份，分別稱取糊精10.2 g(藥輔比1：0.5)、14.2 g(藥輔比1：0.7)、18.3 g(藥輔比1：0.9)，將干浸膏粉與糊精混合，過(guò)篩孔內(nèi)徑0.25 mm使其充分混勻；按一定比例混合，加入適宜的黏合劑制備軟材，擠壓過(guò)篩制粒，干燥30 min。整粒后遵循《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)顆粒成型率、溶化率、休止角等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以此優(yōu)選最佳藥輔比。

根據(jù)復(fù)方肺毒清顆粒制備工藝，按處方稱取各藥材飲片30付，總質(zhì)量為3330 g，置多功能提取器內(nèi)，總共提取3次。第1次加10倍量水，煎煮2 h(水沸騰后計(jì)時(shí))，第2次加8倍量水，煎煮2 h，第3次加6倍量水，煎煮1 h。合并水煎液，濾液濃縮至相對(duì)密度約1.08(60～70 ℃)的稠膏4160 g，將稠膏烘干，得到干膏1218 g(含固率為29.3 %)。采用濕法制粒，篩選藥輔比，綜合評(píng)分顯示最高的藥輔比為1：0.9，但是為減少患者服用量，增加患者的順應(yīng)性，選擇1：0.5比例作為最佳藥輔比(表1)。取20份處方量的干浸膏做小試顆粒，得到水分為3.19%的肺毒清顆粒(每袋10 g)。

表1 藥物與輔料比例考察 Tab.1 Investigation on drug-to-excipient ratio

2.3.2矯味劑選擇 為尋找最佳比例，選用木糖醇作為矯味劑，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：取3 g干膏粉6份，分別加入木糖醇0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 g攪拌均勻。請(qǐng)6名實(shí)驗(yàn)員品嘗口感，均認(rèn)為口感較苦。另選擇甜菊糖作為矯味劑，稱取1.0：0.5藥輔比顆粒1 g，加入甜菊糖0.01 g，相同6名實(shí)驗(yàn)員品嘗口感，均認(rèn)為口感稍甜，具香甜味，故選用1% 甜菊糖作為矯味劑。

2.3.3小試工藝結(jié)果 本品顆粒劑粒度均勻，顆粒顏色由淺棕至深棕色，《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，能通過(guò)篩孔內(nèi)徑2.00 mm但不能通過(guò)篩孔內(nèi)徑0.18 mm的顆粒及粉末所占百分比<15%符合標(biāo)準(zhǔn)，本品顆粒成型率為96.31%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定；休止角是考察藥物的流動(dòng)性，休止角越小，顆粒劑的流動(dòng)性越好[7]，一般認(rèn)為，α≤30 °時(shí)流動(dòng)性好，α≤40 °時(shí)可以滿足生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)流動(dòng)性的需求，本品顆粒的休止角為15.47 °，顆粒的流動(dòng)性較好；顆粒劑的成型率、溶化率、休止角、堆密度具體結(jié)果見表2。

表2 小試生產(chǎn)的復(fù)方肺毒清顆粒(批號(hào)20201201)的檢測(cè)結(jié)果 Tab.2 Test results of compound Feiduqing granules produced in a small scale(batch No.20201201) n=3

吸濕性檢測(cè)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每24 h檢測(cè)1次，分別是24，48，72，96，120，144，168 h測(cè)定顆粒劑的吸濕性，計(jì)算吸濕百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小試生產(chǎn)的復(fù)方肺毒清顆粒，吸濕擬合回歸曲線方程為Y=-0.00 043X2+0.137 7X+1.995 7，R值為0.994 1，其擬合程度較好，平衡吸濕時(shí)間為137.7 h，平衡吸濕率為12.80%，見表3。

表3 復(fù)方肺毒清顆粒(批號(hào)20201201)在不同時(shí)間的吸濕百分率 Tab.3 Moisture absorption rate of compound Feiduqing granules(batch No.20201201) at different times %

2.3.4制劑成型工藝驗(yàn)證 采用濕法制粒，根據(jù)藥輔比篩選，以干膏粉為原料，以糊精和甜菊糖為輔料，75%乙醇、純化水適量作潤(rùn)濕劑，干膏粉：糊精：甜菊糖=1：0.50：0.01的藥輔比進(jìn)行制劑，上述原輔料均過(guò)篩孔內(nèi)徑0.25 mm(60目)后，在篩孔內(nèi)徑1.18 mm(14目)標(biāo)準(zhǔn)篩上擠壓，制濕顆粒，干燥30 min，整粒后分單包裝。按照顆粒劑相關(guān)檢查項(xiàng)目對(duì)其進(jìn)行粒度、水分、溶化率檢查，結(jié)果顯示：該小試顆粒的粒度均<15%，水分均<5%，顆粒均完全溶化，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版顆粒劑相關(guān)檢查要求。

2.4柴胡的薄層鑒別

2.4.1供試品溶液的制備 精密稱取本品顆粒2.0 g，研缽中研細(xì)，加入甲醇12 mL溶解，超聲處理15 min，濾過(guò)，揮干后得濾渣，加入純化水1.5 mL溶解濾渣，溶解后加入水飽和正丁醇溶液5 mL，置于分液漏斗中震蕩萃取3次，將正丁醇合并，揮干正丁醇溶液得濾渣，濾渣加甲醇定容至1.5 mL，作為供試品溶液[8]。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品0.1 mg，加入甲醇2 mL，制成濃度為0.05 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.4.3陰性溶液、對(duì)照藥材溶液的制備 取不含柴胡藥材的陰性顆粒及柴胡藥材，同“2.4.1”項(xiàng)方法制成陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液。

2.4.4鑒別 吸取供試品溶液及陰性對(duì)照溶液5 μL，對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯：乙醇(95%)：水=8：2：1的比例為展開劑進(jìn)行展開，晾干，噴2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液顯色劑，于105 ℃ 加熱至斑點(diǎn)清晰，置紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視[9]。供試品與對(duì)照藥材及柴胡皂苷a對(duì)照品相應(yīng)的色譜位置上顯示相同的黃色熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)，見圖1。

1—3.樣品；4.柴胡；5.柴胡皂苷a對(duì)照品；6.陰性對(duì)照品。圖1 柴胡皂苷a的薄層色譜鑒定 1—3. sample；4.bupleuri radix；5.saikosaponin a reference substance；6.negative reference.Fig.1 TLC identification of saikosaponin a

2.5柴胡皂苷a的含量測(cè)定

2.5.1色譜條件 色譜柱：6 L sciences Inc ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫：0～40 min，85%→40%B；40～45 min，40%→85%B；柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣：20 μL，在此條件下，樣品中柴胡皂苷a與其他成分色譜峰完全分離，和相鄰色譜峰的分離度>1.5。

2.5.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a 5.17 mg，加入甲醇5 mL溶解，配成柴胡皂苷a 1.034 mg·mL-1的母液，密封，放入4 ℃冰箱，備用。

2.5.3供試品溶液的制備 精密稱取樣品10.013 0 g，研缽中研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，超聲(功率：200 W，頻率：40 kHz)30 min，離心取上清液10 mL，揮干后加甲醇定容至5.0 mL即為供試品溶液。

2.5.4陰性溶液的制備 精密稱取缺柴胡的樣品顆粒，同“2.5.3”項(xiàng)方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1專屬性實(shí)驗(yàn) 在選定的色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品與供試品中其他成分色譜峰完全分離，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間上有相同的色譜峰，而陰性溶液無(wú)干擾，見圖2。

2.6.2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 將母液濃度為1.034 mg·mL-1柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品，等比稀釋得0.064 6，0.129 3，0.258 5，0.517 0，1.034 0 mg·mL-15個(gè)濃度樣品，每個(gè)連續(xù)進(jìn)樣2次，每次20 μL。以含量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，柴胡皂苷a線性回歸方程為Y=110.26X+0.935 7，R=1，在0.06～0.98 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，含量與峰面積線性關(guān)系良好。

1.柴胡皂苷a。圖2 陰性對(duì)照品、柴胡皂苷a對(duì)照品、供試品溶液高效液相色譜圖

1.saikosaponin a.

Fig.2 HPLC chromatograms of negative reference，saikosaponin a reference and test sample

2.6.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取柴胡皂苷a對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示柴胡皂苷a峰面積RSD為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.6.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取復(fù)方肺毒清顆粒，按“2.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，結(jié)果顯示：柴胡皂苷a的 RSD為1.493%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取復(fù)方肺毒清顆粒(批號(hào)：20201201)6份，按“2.5.3”項(xiàng)下分別制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定柴胡皂苷a的含量，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，得到柴胡皂苷a的平均含量為0.192 mg·g-1，RSD為0.679%。

2.6.6回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量樣品(批號(hào)：20201201)6份，精密稱定每份2 g；各份樣品中加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下分別制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為97.49%，RSD為1.34%，見表4。

表4 柴胡皂苷a加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab.4 Recovery test results of saikosaponin a

2.7樣品測(cè)定結(jié)果 取不同批次復(fù)方肺毒清顆粒(批號(hào)：20201201，20201202，20201203)，按供試品制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣量20 μL，按“2.5.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行柴胡皂苷a含量測(cè)定，記錄峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示樣品中(每袋10 g)柴胡皂苷a平均含量為0.192 mg·g-1，最低濃度為0.191 mg·mL-1，RSD為0.679%。

3 討論

因中藥復(fù)方制劑藥味多，本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版中的色譜條件，結(jié)合文獻(xiàn)，選擇薄層色譜鑒別所需展開劑，顯色劑比例。對(duì)復(fù)方肺毒清顆粒處方中的桔梗以桔梗皂苷d為對(duì)照品進(jìn)行薄層色譜鑒別，在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)不顯色或顯色不明顯，且與其他斑點(diǎn)未分離，方法不可用，因此未納入本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。柴胡以柴胡皂苷a作對(duì)照品進(jìn)行薄層色譜鑒別，分離效果好，在對(duì)照品相應(yīng)的色譜位置上顯示相同的黃色熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)干擾。故將薄層色譜法鑒別方中柴胡皂苷a納入本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且分離方法可靠。因條件受限，今后課題組將進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)處方中各組分進(jìn)行色譜條件的考察優(yōu)化及鑒別。

提取工藝選用水回流提取法進(jìn)行提取，操作簡(jiǎn)單，符合我國(guó)傳統(tǒng)的中藥提取方法。復(fù)方肺毒清顆粒處方有效成分復(fù)雜，柴胡作為君藥，具有疏散退熱、升舉陽(yáng)氣、疏肝解郁等功效[10-11]。本研究中標(biāo)志物的選擇，遵循了中醫(yī)方劑中“君臣佐使”的原則，采用高效液相色譜法對(duì)方中的柴胡皂苷a進(jìn)行含量測(cè)定[12]，參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行篩選，通過(guò)觀察不同條件及圖譜的變化，最終選擇了最適宜的流動(dòng)相比例及洗脫梯度。結(jié)果表明方法易于操作，重復(fù)性較好。

綜上所述，本研究建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法可行，能有效控制復(fù)方肺毒清顆粒的質(zhì)量。