王莉，劉敏

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，武漢 430014)

人口老齡化是全球性公共衛(wèi)生問題[1]。第7次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示，我國正步入老齡化社會(huì)。衰老是隨著年齡遞增而出現(xiàn)細(xì)胞、組織和器官生理功能與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)紊亂的現(xiàn)象，因此也被認(rèn)為是多種疾病的重要危險(xiǎn)因素[2]。衰老性疾病，尤其是心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)嚴(yán)重危害老年人群的健康[3]。據(jù)報(bào)道，CVDs(包括高血壓、心肌肥大和心力衰竭等)占全世界死亡人數(shù)的約31%[4]，已經(jīng)成為造成老年人死亡的主要原因之一[1]。

器官纖維化是一種伴隨衰老和組織損傷的生理現(xiàn)象，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重構(gòu)造成膠原沉積為常見特征，是人類衰老相關(guān)疾病發(fā)病和死亡的關(guān)鍵誘因[5-6]。其中，心臟纖維化常見于高血壓、心肌梗死和心力衰竭等[7]。纖維化過程參與了包括心臟在內(nèi)的大多數(shù)器官疾病的發(fā)病機(jī)制。目前尚無有效的針對(duì)性治療方法[6]。

刺猬(hedgehog，HH)信號(hào)通路參與細(xì)胞分化、增殖和衰老等多種生物學(xué)過程，尤其在心肌細(xì)胞發(fā)育和心血管系統(tǒng)形成等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]。其中音猬因子(sonic hedgehog，SHH)是HH家族中表達(dá)最為廣泛的成員，其與受體結(jié)合后活化跨膜蛋白Smoothened(SMO)并最終促進(jìn)GLI蛋白的轉(zhuǎn)移和表達(dá)，干預(yù)下游靶基因行為從而參與細(xì)胞活性和組織穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[9]。亞精胺是一種廣泛存在于日常膳食營養(yǎng)中的天然多胺，其在人體組織中的含量隨著年齡的增長而下降[10]。研究顯示，亞精胺具有改善心肌線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡、防治心肌梗死等活性[11]。筆者研究亞精胺對(duì)心肌膠原沉積和氧化應(yīng)激的改善作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 亞精胺(含量>99%，批號(hào)：S107071)、D-半乳糖(D-galactose，D-gal)(含量>99%，批號(hào)：D274314)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。SHH(批號(hào)：00041772)、SMO(批號(hào)：10007493)和GLI-1(批號(hào)：10010981)抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。SMO激動(dòng)劑SAG(批號(hào)：16561)購于美國MCE公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR)檢測(cè)試劑盒SYBR FAST qPCR Master Mix(批號(hào)：KM4101)購于美國KAPA Biosystems公司。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(vimentin，VIM)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)以及膠原COL1A1和COL3A1引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp，批號(hào)：20200808)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，批號(hào)：20200804)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號(hào)：20200808)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批號(hào)：20200808)、過氧化氫酶(catalase，CAT，批號(hào)：20200804)和丙二醛(MDA，批號(hào)：20200804)檢測(cè)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。大鼠心肌細(xì)胞H9c2購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與給藥 H9c2 細(xì)胞于達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco's minimum essential medium ，DMEM)中培養(yǎng)。設(shè)置亞精胺梯度濃度(1，5，10，20，50，100和200 μmol·L-1)干預(yù)組，另平行操作空白培養(yǎng)基等體積干預(yù)設(shè)置為正常對(duì)照組。24 h后CCK-8法檢測(cè)吸光度(A值)計(jì)算細(xì)胞存活率，相對(duì)存活率=(A給藥孔-A培養(yǎng)基孔)/(A正常對(duì)照孔-A培養(yǎng)基孔)。

1.2.2細(xì)胞模型建立 與正常對(duì)照組比較，1～50 μmol·L-1亞精胺孵育并未顯著影響H9c2 細(xì)胞存活率。然而，100和200 μmol·L-1亞精胺孵育則顯著降低了H9c2 細(xì)胞存活率，提示50 μmol·L-1以上的干預(yù)濃度可能具有細(xì)胞毒性。因此選擇20和50 μmol·L-1亞精胺孵育濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用50 mol·L-1D-gal孵育H9c2細(xì)胞[12]，隨機(jī)分為4組：模型對(duì)照組、20 μmol·L-1亞精胺組、50 μmol·L-1亞精胺組和50 μmol·L-1亞精胺+3 nmol·L-1SHH信號(hào)通路激動(dòng)劑組(SAG組)。24 h后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.3比色法檢測(cè)生化指標(biāo) H9c2細(xì)胞按“1.2.2”項(xiàng)操作后，參照試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞Hyp、T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT和MDA的水平。

1.2.4流式檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 H9c2細(xì)胞按“1.2.2”項(xiàng)操作后，用10 μmol·L-1DCFH-DA孵育細(xì)胞，碘化丙啶(propidium iodide，PI) 染色排除死亡細(xì)胞干擾。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)細(xì)胞活性氧(reactive oxgen species，ROS)水平。

1.2.5q-PCR檢測(cè)mRNA水平 H9c2細(xì)胞按“1.2.2”項(xiàng)操作后，參照SYBR FAST qPCR Master Mix說明書步驟，通過q-PCR檢測(cè)COL1A1、COL3A1、E-cad、α-SMA、VIM、FN和TGF-β1的mRNA水平。引物序列見表1。GAPDH為內(nèi)參。

表1 q-PCR引物序列 Tab.1 Primer sequences for q-PCR

1.2.6免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)蛋白表達(dá) 采用Western blotting檢測(cè)SHH信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)蛋白SHH、SMO和GLI-1的表達(dá)量。經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離總蛋白后，依次轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光(electrochemilumine-scence，ECL)，通過TANONGIS軟件記錄灰度值。

2 結(jié)果

2.1亞精胺對(duì)H9c2 細(xì)胞存活率的影響 與正常對(duì)照組比較，D-gal孵育顯著降低H9c2 細(xì)胞的存活率。與模型對(duì)照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著升高細(xì)胞的存活率。與50 μmol·L-1亞精胺單獨(dú)干預(yù)比較，SAG組H9c2 細(xì)胞的存活率顯著降低。見圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與正常對(duì)照組比較，t=2.328，P<0.05；②與正常對(duì)照組比較，t=3.791，P<0.01；③與模型對(duì)照組比較，t=-9.829～-4.035，P<0.01；④與50 μmol·L-1亞精胺組比較，t=2.731，P<0.05。圖1 各組H9c2 細(xì)胞的存活率A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with normal control group，t=2.328，P<0.05；②Compared with normal control group，t=3.791，P<0.01；③Compared with model control group，t=-9.829—-4.035，P<0.01；④ Compared with 50 μmol·L-1spermidine group，t=2.731，P<0.05.Fig.1 The viability of H9c2 cells in each

2.2亞精胺對(duì)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激通過流式檢測(cè)細(xì)胞ROS水平，比色法檢測(cè)細(xì)胞T-AOC、脂質(zhì)過氧化水平(MDA)和抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活力綜合評(píng)價(jià)。與正常對(duì)照組比較，D-gal孵育顯著升高了H9c2細(xì)胞的ROS和MDA水平，降低T-AOC能力，并抑制了SOD、GSH-Px和CAT的酶活力。與模型對(duì)照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著升高細(xì)胞的T-AOC和抗氧化酶活力，降低ROS和MDA水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨(dú)干預(yù)比較，SAG組細(xì)胞ROS和MDA含量顯著升高，T-AOC，SOD和CAT水平降低。見圖2。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對(duì)照組比較，T-AOC，t=-21.138～-10.273；SOD，t=-15.076～-6.314；GSH-Px，t=-11.508～-5.294；CAT，t=-31.15～-6.711；MDA，t=7.807～27.069；ROS，t=6.237～12.522，均P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，T-AOC，t=2.69，P<0.05；③與50 μmol·L-1亞精胺組比較，SOD，t=3.195；CAT，t=3.654；MDA，t=-4.271；ROS，t=-2.432，均P<0.01。圖2 各組H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，T-AOC，t=-21.138—-10.273；SOD，t=-15.076—-6.314；GSH-Px，t=-11.508—-5.294；CAT，t=-31.15—-6.711；MDA，t=7.807-27.069；ROS，t=6.237-12.522，all P<0.01.②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，T-AOC，t=2.69，P<0.05；③Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，SOD，t=3.195；CAT，t=3.654；MDA，t=-4.271；ROS，t=-2.432，P<0.01.Fig.2 Oxidative stress levels of H9c2 cells in each

2.3亞精胺對(duì)H9c2細(xì)胞膠原沉積的影響 通過檢測(cè)細(xì)胞Hyp含量、膠原COL1A1和COL3A1以及TGF-β1的mRNA水平評(píng)價(jià)心肌膠原沉積情況。與正常對(duì)照組H9c2細(xì)胞的Hyp含量(0.100±0.018 )μg·L-1比較，模型對(duì)照組H9c2細(xì)胞的Hyp含量升高至(0.236±0.019) μg·L-1(t=10.556，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺顯著降低Hyp含量至(0.180±0.014)和(0.144±0.015) μmol·L-1(t=4.802，7.720，P<0.01)。與50 μmol·L-1亞精胺組比較，SAG組Hyp含量升高至(0.156±0.019 )μmol·L-1(t=-1.007，P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，D-gal顯著升高COL1A1、COL3A1和TGF-β1的mRNA水平。與模型對(duì)照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著降低COL1A1、COL3A1和TGF-β1的mRNA水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨(dú)干預(yù)比較，SAG組顯著升高COL1A1、COL3A1和TGF-β1的mRNA水平。見圖3。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對(duì)照組比較，TGF-β1，t=7.241～25.052；COL1A1，t=9.777～32.327，；COL3A1，t=4.363～15.39，均P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，TGF-β1，t=-4.117；COL1A1，t=-6.594；COL3A1，t=-3.426，均P<0.01。圖3 各組H9c2 細(xì)胞TGF-β1、COL1A1和COL3A1的 mRNA水平A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，TGF-β1，t=7.241-25.052；COL1A1，t=9.777-32.327；COL3A1，t=4.363—15.39，all P<0.01.②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，TGF-β1，t=-4.117；COL1A1，t=-6.594；COL3A1，t=-3.426，all P<0.01.Fig.3 The mRNA levels of TGF-β1，COL1A1 and COL3A1 in each group of H9c2

2.4亞精胺對(duì)H9c2細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響 通過檢測(cè)EMT標(biāo)記物E-cad、α-SMA、VIM和FN的mRNA水平綜合評(píng)價(jià)細(xì)胞EMT情況。與正常對(duì)照組比較，D-gal孵育顯著降低了H9c2細(xì)胞E-cad的mRNA水平，升高了α-SMA、VIM和FN的mRNA水平。與模型對(duì)照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺顯著升高E-cad的mRNA水平，降低了α-SMA、VIM和FN的mRNA水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨(dú)干預(yù)比較，SAG組E-cad的mRNA水平顯著降低，α-SMA和FN的mRNA水平升高。見圖4。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對(duì)照組比較，E-cad，t=-18.149～-4.482；α-SMA，t=4.792～17.796；VIM，t=4.046～16.765；FN，t=3.429～14.305，均P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，E-cad，t=1.961，α-SMA，t=-2.997，P<0.05。③與50 μmol·L-1亞精胺組比較，t=-3.939，P<0.01。圖4 各組H9c2細(xì)胞E-cad、α-SMA、VIM和FN的mRNA水平A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，E-cad，t=-18.149—-4.482；α-SMA，t=4.792-17.796；VIM，t=4.046-16.765；FN，t=3.429—14.305，all P<0.01.②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，E-cad，t=1.961；α-SMA，t=-2.997，all P<0.05.③Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，t=-3.939，P<0.01.Fig.4 The mRNA levels of E-cad，α-SMA，VIM and FN in each group of H9c2

2.5亞精胺對(duì)H9c2細(xì)胞SHH信號(hào)通路的影響 SHH信號(hào)通路的活躍程度通過檢測(cè)節(jié)點(diǎn)蛋白SHH、SMO和GLI-1的表達(dá)量評(píng)價(jià)。與正常對(duì)照組比較，D-gal孵育顯著升高了H9c2細(xì)胞SHH、SMO和GLI-1的表達(dá)水平。與模型對(duì)照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著降低細(xì)胞SHH、SMO和GLI-1的表達(dá)水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨(dú)干預(yù)比較，SAG組細(xì)胞SHH、SMO和GLI-1的表達(dá)水平顯著升高。見圖5。結(jié)合前文結(jié)果，亞精胺減輕心肌膠原沉積的作用機(jī)制可能與抑制SHH信號(hào)通路和氧化應(yīng)激有關(guān)(圖6)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對(duì)照組比較，SHH，t=7.923～22.332；SMO，t=6.302～22.620；GLI-1，t=6.307～22.218，P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，SHH，t=-2.755；GLI-1，t=-2.054，P<0.05。③與50 μmol·L-1亞精胺組比較，t=-10.242，P<0.01。圖5 各組H9c2細(xì)胞SHH、SMO和GLI-1蛋白表達(dá)水平A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，SHH，t=7.923—22.332；SMO，t=6.302—22.620；GLI-1，t=6.307—22.218，all P<0.01；②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，SHH，t=-2.755；GLI-1，t=-2.054，P<0.05.③Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，t=-10.242，P<0.01.Fig.5 The protein expression levels of SHH，SMO and GLI-1 in each group of H9c2

圖6 亞精胺的作用機(jī)制 Fig.6 Mechanisms of spermidine

3 討論

膠原沉積是器官纖維化的關(guān)鍵病理特征[11]。因此，心肌膠原沉積也是心臟纖維化導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能破壞的病理原因之一，將加速心肌梗死、肥厚型心肌病和心臟衰竭等疾病的進(jìn)展[13]。H9c2心肌細(xì)胞株來源于大鼠心臟，被廣泛應(yīng)用于CVDs的研究中，尤其適用于衰老相關(guān)性疾病的防治研究[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺能夠有效改善D-gal誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的膠原沉積，提示亞精胺具有減緩衰老引起的心臟纖維化的潛力。

EMT是器官纖維化形成的核心途徑之一，在分子水平上表現(xiàn)為上皮標(biāo)記物E-cad逐漸缺失，間質(zhì)標(biāo)記物VIM、α-SMA和FN等過表達(dá)。一方面，E-cad對(duì)維持細(xì)胞正常黏附連接至關(guān)重要。E-cad缺失和VIM過表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組并獲得運(yùn)動(dòng)能力。另一方面，α-SMA的陽性表達(dá)是成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)ECM重構(gòu)和膠原沉積的標(biāo)志性事件之一[16]。此外，TGF-β是強(qiáng)力的促纖維化細(xì)胞因子，與α-SMA和VIM等EMT指針的過表達(dá)密切相關(guān)[13]。TGF-β1能夠下調(diào)E-cad，上調(diào)α-SMA和FN的表達(dá)，促進(jìn)H9c2細(xì)胞EMT[17]。本研究證實(shí)，亞精胺改善心肌膠原沉積的效應(yīng)與抑制TGF-β1和EMT有關(guān)。

氧化應(yīng)激是心肌損傷的誘因之一。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)抗氧化體系負(fù)責(zé)維持細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡。各種因素導(dǎo)致的抗氧化酶活力被抑制，都將引起體內(nèi)抗氧化防御體系的破壞，造成ROS聚集，最終出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[15]。SHH信號(hào)通路參與衰老相關(guān)的細(xì)胞氧化應(yīng)激[18]。事實(shí)上，各種細(xì)胞信號(hào)通路存在廣泛的交連，而SHH信號(hào)通路處于關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)位置[19]。SHH信號(hào)通路的活躍能夠通過誘導(dǎo)其下游靶標(biāo)TGF-β、EMT轉(zhuǎn)錄因子和膠原基因等表達(dá)而連接TGF-β、促纖維化效應(yīng)、EMT程序和膠原沉積等生理活動(dòng)[20]。氧化應(yīng)激的形成將協(xié)同SHH信號(hào)通路進(jìn)一步加速器官纖維化進(jìn)程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺能夠顯著抑制H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激、EMT和SHH信號(hào)通路。而SHH信號(hào)通路激動(dòng)劑SAG在一定程度上抵消了亞精胺的上述作用。綜上所述，亞精胺能夠通過抑制SHH信號(hào)通路減輕心肌膠原沉積和氧化應(yīng)激，提示亞精胺具有改善心臟衰老的潛在應(yīng)用價(jià)值。筆者在下一步研究中將在體內(nèi)水平予以深入探討。