楊大為，鄧勇，張超，欒明寶，黃思齊，李建軍，常麗，潘根，唐慧娟，李德芳

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部麻類生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

由于不合理灌溉、過度開發(fā)土地、氣候干旱和地勢(shì)低洼等因素，全球范圍內(nèi)土壤鹽漬化程度逐年加重，環(huán)境與可持續(xù)農(nóng)業(yè)之間的矛盾日益凸顯[1-2]。針對(duì)當(dāng)下形勢(shì)，培育耐鹽作物新品種是開發(fā)利用鹽堿地最有效的措施之一。紅麻(Hibiscus cannabinusL.)是重要的纖維作物之一，廣泛應(yīng)用于麻紡、飼料、造紙、活性炭、建材等諸多領(lǐng)域。紅麻具有生長(zhǎng)周期短、生物量大、抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，賦予其極大的土壤改良潛力[3]。據(jù)報(bào)道，紅麻的耐鹽性強(qiáng)于玉米、高粱、鹽地堿蓬、高丹草，能夠在含鹽量0.4%左右的環(huán)境中正常生長(zhǎng)[4-5]。但目前有關(guān)紅麻耐鹽性的研究主要局限于耐鹽性評(píng)價(jià)和生理生化方面，分子機(jī)制方面研究較少，這嚴(yán)重限制了紅麻育種技術(shù)的發(fā)展。

MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于生物界當(dāng)中，是一類具有特定DNA結(jié)合域(DBD)的蛋白質(zhì)[6]。最早在植物中發(fā)現(xiàn)的MYB基因是從玉米中分離出的MYBC1，作用于色素合成調(diào)控[7]。MYB蛋白序列大多每間隔18個(gè)左右氨基酸會(huì)存在1個(gè)色氨酸(W)殘基，這些殘基能夠使該蛋白形成HTH結(jié)構(gòu)，從而具有高度保守性?；谥貜?fù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量(1R、2R、3R、4R)可將MYB蛋白分為4個(gè)亞類[8]，其中含有2個(gè)R結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白(R2R3-MYB)相關(guān)研究較多[7]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量是4個(gè)亞類中最多的，在擬南芥中占64.3%，水稻中占56.77%，并且其N末端和C末端具有多樣性和特異性，賦予了該類轉(zhuǎn)錄因子更多的生物學(xué)功能[9-10]。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能，不僅參與對(duì)逆境脅迫和植物激素的應(yīng)答，還參與丙酮素代謝途徑和植物細(xì)胞形態(tài)建成。研究發(fā)現(xiàn)，蘋果的MdMYB2作為轉(zhuǎn)基因植物育種中的正向調(diào)控因子，顯著提高了植株對(duì)鹽脅迫的抗性[11]，并且MdMYB121在植物響應(yīng)低溫和高鹽脅迫過程中也發(fā)揮了重要作用[12]；草莓的FvMYB24可以與SOS1啟動(dòng)子結(jié)合提高植物耐鹽性[13]；在大豆中過表達(dá)GmMYB81也增強(qiáng)了植物對(duì)干旱和鹽分的耐受性[14]。此外，許多MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要通過依賴脫落酸(ABA)信號(hào)途徑應(yīng)答非生物脅迫。ABA處理和鹽脅迫下，水稻幼苗OsMYB84基因表達(dá)上調(diào)，作用機(jī)制類似的轉(zhuǎn)錄因子還有DfMYB2、TaMYB33、AtMYB20等[15-18]。MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)多樣，功能復(fù)雜，在植物的抗逆調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。但目前紅麻MYB相關(guān)研究少有報(bào)道，因此深入研究紅麻MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

目前紅麻基因組數(shù)據(jù)已公布，本研究根據(jù)課題組前期紅麻鹽脅迫有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出鹽脅迫應(yīng)答關(guān)鍵基因HcMYB3，克隆其CDS全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及鹽脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)分析，以期為紅麻抗逆分子育種工作提供候選基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

本研究選用的試驗(yàn)材料為“中紅麻21號(hào)”，是課題組前期選育的耐鹽品種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所提供。選取籽粒飽滿并已消毒的種子點(diǎn)播于墊有濕潤(rùn)濾紙的發(fā)芽盒中，在恒溫光照培養(yǎng)箱中(30℃光照16 h/25℃黑暗8 h)進(jìn)行催芽。3 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼芽播于裝有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培盆中，在植物生長(zhǎng)帳篷中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(光/暗交替16 h/8 h，光照強(qiáng)度為3000 Lx，溫度為25～27℃，相對(duì)濕度為60%～70%)。預(yù)培養(yǎng)7 d后，第二次篩選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)入另一裝有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培盆中進(jìn)行NaCl處理，每盆12株幼苗，一盆為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。NaCl處理濃度為0、50、150、250 mmol/L，每天更換一次處理液，于第3天(72 h)取幼苗從上至下第3片真葉速凍于液氮中，在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HcMYB3基因克隆

從紅麻鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出HcMYB3基因(Hca.05G0000990)，根據(jù)預(yù)測(cè)的ORF區(qū)域，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物:HcMYB3-F1(5′-3′):CTTTGAGCATCGTCCCTAACG，加酶切位點(diǎn) xho1；HcMYB3-R1(5′-3′):GGGAGATGGATTTTGGGTTTC，加酶切位點(diǎn) sma1。 使用OMEGA公司的總RNA快速提取試劑盒提取紅麻幼苗新鮮葉片的總RNA，然后采用FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN)去除gDNA，合成第一鏈cDNA。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增HcMYB3基因的cDNA全長(zhǎng)序列，反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s；退火55℃ 30 s；延伸72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min，4℃冷卻保存。使用1%瓊脂糖凝膠將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，再使用DNA膠回收試劑盒(TIANGEN)回收并純化PCR目的片段，然后與pTOPOBlunt Vector(Aidlab)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性板上篩選挑菌，經(jīng)過菌液PCR后挑選陽性克隆菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 HcMYB3生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPASy中的Protparam程序分析HcMYB3蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度、分子量和等電點(diǎn)等信息；利用ProtScale軟件分析HcMYB3蛋白的親/疏水性；利用NCBI-CD-search工具預(yù)測(cè)HcMYB3蛋白的保守功能域；利用TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)HcMYB3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，并利用Signal IP 6.0工具預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用NetPhos 2.0預(yù)測(cè)HcMYB3蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用SOPMA工具預(yù)測(cè)HcMYB3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在Phyre 2網(wǎng)站獲取該蛋白pdb格式文件，通過PyMOL軟件繪制三級(jí)結(jié)構(gòu)；最后在NCBI網(wǎng)站中采用blastp工具對(duì)HcMYB3蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，隨后與高同源性物種的MYB3蛋白序列一起導(dǎo)入MEGA-X軟件中，運(yùn)用比鄰接法(Neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 HcMYB3表達(dá)模式分析

選擇beta-actin作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)引物為HcMYB3-F2(5’-3’):GAAACCCAAAATCCATCTCCC，HcMYB3-R2(5’-3’):GGTTCCGTTTTCGTCGTCA。 使用 OMEGA公司的總RNA快速提取試劑盒提取不同處理下紅麻幼苗葉片的總RNA，合成cDNA后，利用CFX96系統(tǒng)(Bio-Rad)和Master qPCR Mix(SYBR GreenⅠ)(TSINGKE)根據(jù)試劑盒推薦程序進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。參照Livak and Schmittgen(2001)的方法采用2-△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)水平[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻HcMYB3基因克隆

以紅麻幼苗葉片的cDNA為模板，用特異性引物HcMYB3-F1和HcMYB3-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化一系列步驟后，得到陽性克隆菌液。菌液PCR顯示，擴(kuò)增條帶與目的基因片段長(zhǎng)度一致(圖1)。經(jīng)測(cè)序，片段序列與目的基因序列完全一致，表明克隆成功。通過NCBI網(wǎng)站的blastp比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與擬南芥AtMYB3蛋白高度同源，因此命名為HcMYB3。

圖1 紅麻HcMYB3基因陽性克隆PCR擴(kuò)增片段Fig.1 PCR amplified fragments of positive clones of kenaf HcMYB3 gene

2.2 紅麻HcMYB3基因序列分析

利用NCBI網(wǎng)站ORFfinder工具預(yù)測(cè)克隆獲得的CDS序列的開放閱讀框(圖2)，該基因全長(zhǎng)675 bp，位于紅麻第4條染色體上，編碼224個(gè)氨基酸，分子式為C1119H1751N327O355S3，分子量為25 561.37，不穩(wěn)定系數(shù)為42.31，超過閾值40，等電點(diǎn)為6.11，是不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。通過Pfam工具分析HcMYB3蛋白氨基酸序列結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白中存在兩段MYB轉(zhuǎn)錄因子特有的DNA結(jié)合域，分別位于第10～55位和第170～209位，表明該蛋白為R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子。亞細(xì)胞定位推測(cè)，HcMYB3蛋白在第70～86位氨基酸含有一段核定位信號(hào)基序(KKLPDPVLQAVRKRKKT)，表明該蛋白主要定位于細(xì)胞核中。

圖2 紅麻HcMYB3全長(zhǎng)ORF序列和氨基酸序列Fig.2 Full-length ORF sequence and amino acid sequence of kenaf HcMYB3

2.3 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白的親/疏水性分析

親/疏水性變化與蛋白結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。對(duì)HcMYB3基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親/疏水性分析(圖3)，在第24位氨基酸出現(xiàn)最高峰，峰值為1.744，即疏水性最強(qiáng)；在第161位氨基酸出現(xiàn)最低峰，峰值為-3.122，即親水性最強(qiáng)。整體來看，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，并均勻分布在肽鏈中，推測(cè)HcMYB3基因編碼的蛋白質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)。

圖3 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白的親/疏水性分析Fig.3 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of HcMYB3 encoded protein

2.4 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

對(duì)HcMYB3基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖4)，該蛋白在膜外的概率接近1，具有跨膜結(jié)構(gòu)的可能性較低。推測(cè)HcMYB3蛋白的224個(gè)氨基酸殘基幾乎完全位于膜外。因此可知，該蛋白不存在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，同樣也不是膜上受體。

圖4 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of transmembrane structure of HcMYB3 encoded protein

2.5 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白的信號(hào)肽分析

信號(hào)肽位于分泌蛋白N端，一般含有5～30個(gè)氨基酸殘基。HcMYB3蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖5)，代表剪切位點(diǎn)的C值并無較大變化，代表信號(hào)肽區(qū)域的S值波動(dòng)較小，并且綜合參數(shù)Y值相對(duì)平穩(wěn)，因此推測(cè)該蛋白不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

圖5 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of signal peptide region of HcMYB3 encoded protein

2.6 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)分析

大部分蛋白質(zhì)要發(fā)揮其功能都需要經(jīng)歷翻譯后修飾過程，蛋白的翻譯后修飾包括磷酸化、乙?；?、糖基化等。對(duì)HcMYB3基因編碼蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，由表1可知，該蛋白存在28個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的磷酸化勢(shì)見圖6。預(yù)測(cè)到的磷酸化位點(diǎn)包括15個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、11個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，并且在預(yù)測(cè)到的磷酸化激酶中大部分為CKII。并未在該蛋白上預(yù)測(cè)到其他翻譯后修飾位點(diǎn)。

圖6 HcMYB3基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of phosphorylation sites of HcMYB3 encoded protein

表1 HcMYB3基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of phosphorylation sites of HcMYB3 encoded protein

2.7 紅麻HcMYB3基因編碼蛋白產(chǎn)物的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA軟件預(yù)測(cè)紅麻HcMYB3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HcMYB3蛋白由α螺旋結(jié)構(gòu)、延伸鏈結(jié)構(gòu)、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成，分別占25.45%、11.16%、4.46%和58.93%。在Phyre 2網(wǎng)站中獲取HcMYB3蛋白三維空間模型的pdb文件，隨后利用PyMOL軟件繪制該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖8)，從分析數(shù)據(jù)中可得到，HcMYB3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)中含有57個(gè)α螺旋、25個(gè)延伸鏈、10個(gè)β轉(zhuǎn)角和132個(gè)無規(guī)則卷曲。

圖7 HcMYB3基因編碼蛋白產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Secondary structure of HcMYB3 encoded protein

圖8 HcMYB3基因編碼蛋白產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Tertiary structure of HcMYB3 encoded protein

2.8 紅麻HcMYB3基因同源進(jìn)化樹分析

利用NCBI-blastp對(duì)HcMYB3蛋白序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與14個(gè)不同物種的氨基酸序列相似度較高，其中與木槿(KAE8703642.1)、黃褐棉(TYJ04862.1)、榴蓮(XP_022757570.1)、可可樹(XP_007051504.1)、哥倫比亞錦葵(XP_021280377.1)、開心果(XP_031285530.1)的氨基酸序列相似度分別為87.11%、75.86%、66.53%、64.88%、64.05%、58.92%。之后利用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖9)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與木槿(Hibiscus syriacusLinn.)親緣關(guān)系最近，此外與黃褐棉(Gossypium mustelinum)、榴蓮(Durio zibethinusMurr.)、可可樹(Theobroma cacao)和哥倫比亞錦葵(Herrania umbratica)的親緣關(guān)系也相對(duì)較近。

圖9 紅麻HcMYB3基因同源進(jìn)化樹比對(duì)Fig.9 Comparison of homologous evolutionary trees of HcMYB3 gene in kenaf

2.9 紅麻幼苗葉片HcMYB3表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)研究紅麻苗期在不同濃度鹽脅迫下HcMYB3基因的表達(dá)水平。結(jié)果(圖10)表明，在50、150 mmol/L鹽脅迫下，HcMYB3基因的表達(dá)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，并且在150 mmol/L鹽脅迫下的表達(dá)量增幅最大，達(dá)到對(duì)照的4.78倍。當(dāng)NaCl濃度為250 mmol/L時(shí)，HcMYB3基因的表達(dá)量與對(duì)照相比無明顯變化，可能高濃度鹽脅迫抑制了該基因的表達(dá)。

圖10 鹽脅迫下紅麻幼苗HcMYB3基因的表達(dá)水平Fig.10 Expression levels of HcMYB3 gene in kenaf seedlings under salt stress

3 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子參與眾多生物學(xué)過程，功能廣泛，主要參與植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、葉片形態(tài)建成、次生代謝和脅迫應(yīng)答等過程，并作為端粒結(jié)合蛋白參與保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和功能。然而，目前MYB轉(zhuǎn)錄因子的深入研究主要集中于擬南芥、水稻和大豆等植物，在紅麻中鮮有報(bào)道[20-22]。本研究從紅麻鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出HcMYB3基因，獲得該基因完整的CDS序列后成功對(duì)其進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和鹽脅迫響應(yīng)分析，為更好地開展紅麻MYB轉(zhuǎn)錄因子研究奠定基礎(chǔ)。

對(duì)克隆的HcMYB3基因ORF區(qū)段進(jìn)行生信分析，發(fā)現(xiàn)該基因具有兩個(gè)MYB特有的DNA結(jié)合域，是一個(gè)R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，位于紅麻第4條染色體上，全長(zhǎng)為675 bp，推測(cè)其編碼224個(gè)氨基酸，主要在細(xì)胞核中行使轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能，并且與木槿的親緣關(guān)系最近。目前，在非生物脅迫方面關(guān)于MYB3基因的研究取得了一定進(jìn)展。苧麻BnMYB3基因在鎘脅迫下明顯上調(diào)，桃PpMYB3基因的表達(dá)量與環(huán)境溫度變化趨勢(shì)相一致，可能參與調(diào)控植物對(duì)溫度的響應(yīng)[23-24]。此外，利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)苜蓿MtMYB3顯著抑制了冷適應(yīng)激活因子MtCBF4的表達(dá)，并且過表達(dá)該基因顯著降低了植物耐寒性，表明MtMYB3可能負(fù)調(diào)控植物耐寒性[25]。在植物激素響應(yīng)方面，甘薯IbMYB3和梁山慈竹DfMYB3均受到脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)的誘導(dǎo)[26-27]。綜上所述，MYB3基因可能參與調(diào)控植物非生物脅迫響應(yīng)。

在本研究中，中低濃度鹽(50、150 mmol/L NaCl)脅迫誘導(dǎo)HcMYB3基因顯著上調(diào)，其中150 mmol/L NaCl處理誘導(dǎo)該基因上調(diào)了3.78倍，而高濃度鹽(250 mmol/L NaCl)脅迫并未明顯誘導(dǎo)該基因表達(dá)，表明該基因可能參與調(diào)控紅麻鹽脅迫響應(yīng)。本研究結(jié)果與前人關(guān)于鹽脅迫下甘薯和枳中IbMYB3和PtrMYB3基因的研究結(jié)果一致[26，28]，即鹽脅迫能使MYB3基因上調(diào)表達(dá)。但關(guān)于MYB3基因?qū)χ仓昴望}性的調(diào)控作用，這兩項(xiàng)研究得出了相反的結(jié)論。在擬南芥中對(duì)來自甘薯的IbMYB3基因異源超表達(dá)增強(qiáng)了植株耐鹽性，表明該基因具有增強(qiáng)植物耐鹽性的潛力[26]。而利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)使枳的PtrMYB3基因沉默后顯著增強(qiáng)了植物的耐鹽性，并且在煙草中過表達(dá)該基因會(huì)損害植物耐鹽性，表明該基因負(fù)調(diào)控植物耐鹽性[28]。因此，HcMYB3基因在紅麻耐鹽方面具體擁有何種調(diào)控作用，后續(xù)還需通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究從紅麻幼苗中克隆出HcMYB3基因。生信分析結(jié)果表明:HcMYB3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)量由多至少依次為無規(guī)則卷曲、α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角，該蛋白具有酸性、不穩(wěn)定、親水性、不跨膜、不含信號(hào)肽的特性，與木槿HsMYB3同源性最高。鹽脅迫下紅麻幼苗葉片中HcMYB3基因的qRTPCR結(jié)果顯示，鹽脅迫誘導(dǎo)該基因表達(dá)上調(diào)，表明HcMYB3基因參與調(diào)控紅麻耐鹽應(yīng)答。