任慶肖，張金旭，王繼華，徐世強，姚偉，張木清

(1. 廣西大學農學院/廣西甘蔗生物學重點實驗室/亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；2. 廣東農業(yè)科學院作物研究所，廣東 廣州 510640)

甘蔗(Saccharum officinarum)廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重要的糖料作物，也是最好的可再生生物質能源作物之一[1]。 果蔗(chewing cane)是一種可鮮食的水果型甘蔗，其口感清甜，營養(yǎng)豐富，深受人們的青睞[2]，是我國南方重要的經濟作物，廣泛種植于廣東、廣西、浙江、福建和云南等地區(qū)，主栽品種為“拔地拉”(Badila)，其種植面積占果蔗總面積的70%[3]。 近年來，廣東蔗區(qū)根腐病連年加重，造成大面積減產，嚴重打擊農戶的果蔗種植積極性，對果蔗產業(yè)健康發(fā)展構成嚴重威脅。

甘蔗根腐病是一種發(fā)生在甘蔗根部的土傳性病害，在果蔗上尤為嚴重。 2018年本實驗室首次報道了由Fusarium commune(共享鐮刀菌)引起的甘蔗根腐病，通過田間調查發(fā)現(xiàn)患病果蔗生長初期田間表現(xiàn)植株矮小，發(fā)根力弱，根系逐漸變褐、變軟和腐爛，葉片因根系吸收水分、養(yǎng)分能力下降而出現(xiàn)卷曲、發(fā)黃甚至枯萎，嚴重時植株死亡；即使部分幼苗仍能繼續(xù)帶病生長，但生長后期植株纖細，莖基部和根部的縱切面呈現(xiàn)黑褐色[4]。 而健康植株表現(xiàn)為地上部生長良好，根系發(fā)達且附著土壤的能力強(圖1)。 調查發(fā)現(xiàn)，根腐病對甘蔗產量影響巨大，發(fā)病地塊平均減產30%～50%，造成重大經濟損失。 因此，初步認為果蔗根腐病是一種新興的較為嚴重的病害，該病害貫穿于果蔗整個生長期，果蔗生長初期(2 ～3 個月)最易感染根腐病，應加以重視并及時防治。

圖1 果蔗根腐病患病與健康植株及其根系的田間表型

本研究對廣東省廣州市果蔗區(qū)根腐病田間發(fā)病情況進行調查并采集發(fā)病樣品分離病原菌，通過形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定并測定其致病性，初步分析其生物學特性，以期為果蔗病害防治和病原菌研究提供理論依據(jù)，保障果蔗產業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為具有典型根腐病癥狀的果蔗植株樣品，2019年12月采集于廣東省廣州市番禺區(qū)果蔗種植基地，采集后立即送往實驗室進行處理。

1.2 病原菌的分離與純化

采用傳統(tǒng)組織分離法進行病原菌的分離，具體方法為:首先將患病植株根系洗凈瀝干水分，置于超凈工作臺上，用滅菌手術刀在患病根部的病健交界處切取5 mm 的根段，75%乙醇消毒30 s，后移至無菌水中洗滌3 次，最后用滅菌濾紙吸干多余水分，接種于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基(含鏈霉素、噻孢霉素)中央，28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2 ～3 d。 不斷對菌落進行純化，直至菌落整齊一致沒有雜菌出現(xiàn)，獲得分離菌株，用于后續(xù)鑒定。

1.3 形態(tài)學與分子生物學鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定 用打孔器沿分離菌株的菌落邊緣打取6 mm 菌餅接種在PDA 平板上，28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、顏色、質地以及氣生菌絲的生長狀況等培養(yǎng)性狀。 配制土壤瓊脂培養(yǎng)基以觀察厚垣孢子[5]。 培養(yǎng)數(shù)天后，挑取菌絲在光學顯微鏡、熒光顯微鏡以及掃描電子顯微鏡下觀察分離菌株的顯微形態(tài)特征，并在顯微鏡下拍照，按照Skovgaard 等[2]的方法對分離菌株進行形態(tài)學鑒定。

1.3.2 分子生物學鑒定 DNA 提取:將分離菌株接種在PDW(馬鈴薯葡萄糖水)培養(yǎng)基上，28℃搖床培養(yǎng)3 d 后，用四層滅菌紗布過濾，收集200 mg新鮮菌體，用全自動樣品快速研磨儀進行預冷研磨，采用SDS 裂解法提取病原菌基因組DNA。 提取的DNA 置于-20℃冰箱中暫時保存。

PCR 擴增:采用真菌ITS 序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、鐮刀菌特異性引物EF1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF2(5′-GGAAGTACCAGTSATCATGTT-3′)[7]對病原菌基因組DNA 進行PCR 擴增。 PCR 擴增產物送至生物工程(上海)股份有限公司進行純化和檢測。

序列比對:登錄NCBI 網站(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通過BLAST 功能將測序結果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索和比對分析，初步確定分離菌株的種屬。

系統(tǒng)發(fā)育分析:從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載已知種名的近源菌TEF1-α基因序列，利用MEGA-7 軟件進行ClustalW 多序列比對后，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建基于TEF1-α序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行Bootstrap重復分析1000 次，從而確定其系統(tǒng)發(fā)育關系。

1.4 致病性測定

將果蔗莖用多菌靈消毒后，25℃(保持濕潤)催芽7 d 長出健康根系，作為后續(xù)待處理植株。用打孔器沿分離菌株菌落邊緣打取菌餅接種在PDA 平板上，28℃黑暗培養(yǎng)5～7 d，用挑針輕輕刮下菌落，8 層紗布過濾菌絲得到孢子懸浮液，用無菌水將孢子懸浮液濃度調至1.0×106cfu/mL。 室溫條件下，將10 mL/株的分生孢子懸浮液均勻接種在果蔗植株的根圍，以接種10 mL/株無菌水作為對照處理，每處理重復3 次。 處理后1～20 d 連續(xù)觀察植株根系的發(fā)病情況，出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀后，對病原菌進行再分離和柯赫氏法則驗證。

1.5 生物學特性研究

將分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用打孔器沿其菌落邊緣打取6 mm 菌餅，分別接種在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)、LA(LB 肉湯瓊脂)、CDA(察氏瓊脂)、MEA(麥芽浸膏瓊脂)、SDA(沙氏葡萄糖瓊脂)、SAM(改良沙氏瓊脂)6 種培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)，每處理重復3 次，每隔24 h 采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)7 d 后，在培養(yǎng)皿中加10 mL 無菌水，制備孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定每個處理下的孢子產量。

將6 mm 菌餅接種在PDA 培養(yǎng)基上，分別置于16、20、24、28、32℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理重復3 次，每隔24 h 采用十字交叉法測量菌落直徑。 培養(yǎng)7 d 后，用血球計數(shù)板測定不同溫度處理下的孢子產量。

用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液調節(jié)pH，配制不同pH 值(pH＝3～11)的PDA 培養(yǎng)基，將6 mm 菌餅接種在培養(yǎng)基上，置于28℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理重復3 次，每隔24 h 采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)7 d 后用血球計數(shù)板測定不同pH 值處理下的孢子產量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學特征

本試驗共分離27 株菌，其中6 株與Fusariumcommune(共享鐮刀菌)[6]形態(tài)特征相似(編號為F.C6、F.C15、F.C16、F.C25、F.C27、gx4-46)，主要形態(tài)特征如下。

在PDA 培養(yǎng)基上菌落顏色為白色，菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，氣生菌絲較少且為絨毛狀，培養(yǎng)數(shù)天后，菌落不變色，培養(yǎng)基背面逐漸變?yōu)榈S色。 小分生孢子較多，呈卵圓形，大小為(3.11 ～13.09)μm×(1.69 ～3.86) μm；大分生孢子較少，呈長卵形微彎或月牙形兩端微尖，隔膜最多為3 個，大小為(11.05 ～33.21)μm×(3.03 ～5.65)μm。 掃描電鏡下的分生孢子形態(tài)為扁船形或腹側內卷狀。 光學顯微鏡下觀察的分生孢子梗多為粗短的簡單瓶梗，偶爾出現(xiàn)較為細長的單瓶梗。 厚垣孢子為球形，直徑(5.49～10.95)μm。 由于分離菌株可以產生長度超過25 μm 的細長單瓶梗，符合Skovgaard等[6]對F. commune區(qū)別于尖孢鐮刀菌的形態(tài)特征描述，因此初步鑒定為F. commune(圖2)。

圖2 分離菌株gx4-46 的顯微形態(tài)特征

2.2 分子生物學鑒定

測序結果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，結果顯示分離菌株的TEF1-α基因序列與GenBank 中F. commune( GenBank 登 錄 號:MT947795.1)的相應片段相似度均達到99%以上，E-value 值為0。

利用MEGA-7 軟件將分離菌株和已知種名的鐮刀菌菌株的基因序列(表1)進行聚類分析，選取F.solani(登錄號:DQ247544.1)作為外群，采用NJ 法構建基于TEF1-α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。 結果顯示供試菌株與F. commune處于同一分支，分支置信度為98%(圖3)。 因此將該6 株分離菌鑒定為F. commune。

圖3 基于TEF1-α 基因序列采用鄰接法構建的分離菌株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的菌株及其GenBank 登錄號

2.3 致病性測定

致病性測定結果(圖4)顯示，接種分離菌株后果蔗根系均有一定程度的發(fā)病，表現(xiàn)為植株矮小，生長緩慢，主根逐漸變?yōu)樯詈稚橛胁煌潭鹊母癄€，新生根的數(shù)量減少，和田間發(fā)病情況相似。 不同菌株對果蔗根系的致病力不同，接種gx4-46 菌株后根系的發(fā)病率高達79.96%，顯著高于其他菌株，F(xiàn).C16、F.C27、F.C25、F.C15、F.C6的發(fā)病率分別為25. 13%、20. 09%、17. 86%、16.50%、12.77%(圖5)。

圖4 致病性測定結果

圖5 接種不同菌株的果蔗根系發(fā)病率

2.4 生物學特性

2.4.1 培養(yǎng)基對菌株生長的影響 gx4-46 菌株在不同培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同的生長特性(圖6)。在LA 培養(yǎng)基中氣生菌絲發(fā)達，菌絲生長最快，菌落直徑平均生長速率為1.47 cm/d，之后依次為CDA 培養(yǎng)基、MEA 培養(yǎng)基、SDA 培養(yǎng)基、SAM 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基。 在CDA 培養(yǎng)基上菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，菌絲紋路清晰，但氣生菌絲體較少。菌株在LA 培養(yǎng)基上產孢量最大，顯著高于其他處理。 可見LA 培養(yǎng)基為該菌株的最適培養(yǎng)基。

圖6 培養(yǎng)基對gx4-46 菌絲生長速率和孢子產量的影響

2.4.2 溫度對菌株生長的影響 由圖7 可知，在16～32℃范圍內果蔗根腐病病原菌均能生長。 當溫度為24℃時菌絲生長最快，菌落直徑平均生長速率為1.13 cm/d，生長7 d 天后的孢子產量為6.07×106個/mL，均顯著高于其他培養(yǎng)溫度。 因此，24℃為最適合該菌株菌絲生長的溫度。

圖7 培養(yǎng)溫度對gx4-46 菌絲生長速率和孢子產量的影響

2.4.3 pH 值對菌株生長的影響 果蔗根腐病病原菌對酸堿度的適應范圍廣泛，在pH 值為3 ～11 范圍內均可生長。 pH ＝7 時最適合病原菌的生長，菌落直徑平均生長速率為1.39 cm/d。 在pH 值為3～11 范圍內均能產孢，pH＝11 時產孢量最大，pH 為3～4 時幾乎不產孢(圖8)。

圖8 pH 值對gx4-46 菌絲生長速率和孢子產量的影響

3 討論與結論

本試驗從果蔗根腐病根系樣品中分離到的27 株分離物中，有6 株被鑒定為Fusarium commune，分離頻率為22.22%。 致病性測定結果表明，供試菌株間存在一定的致病性差異，與前人的研究結果相同[5，8]。 果蔗根系接種gx4-46 菌株后發(fā)病嚴重，發(fā)病率高達79.96%，因此，選取該菌株進行進一步生物學特性分析。 結果表明，LA 培養(yǎng)基為病原菌的最適培養(yǎng)基；24℃為該菌株菌絲生長的最適溫度，這與曾莉莎等[9]對荷花腐敗病菌以及張河慶等[10]對豇豆根腐病病原菌的菌絲最適生長溫度的研究結果相似；pH ＝7 最適合該菌株的生長。

已知為害甘蔗根部的主要病原菌有Pythium arrhenomanes(強雄腐霉)、Pachymetra chaunorhiza、Macrophomina phaseolina(殼球孢菌)、Xylaria arbuscula(木生炭角菌)等[11-15]。 2018年本實驗室首次報道了由F. commune引起的甘蔗根腐病[4]，F(xiàn). commune作為尖孢鐮刀菌的姐妹種[6]，是一種具有廣泛寄主范圍和地理分布的植物致腐病菌，能引起道格拉斯冷杉[16]、美國森林苗圃[17]、水 稻[5]、大 豆[18]、煙 草[19]、豇 豆[10]、番茄[20]和軟棗獼猴桃[21]等多種作物的根腐病。 在水量豐富的地區(qū)或者水生植物上，該菌更容易生存繁殖。 如近年來報道的較為嚴重的荷花腐敗病以及荸薺枯萎病均由該菌引起[22，23]。 福建省煙草種植區(qū)普遍采用煙草與水稻輪作的種植方式，根腐病病原菌可能廣泛存在于水田中[19]。 百合枯萎病在5、6月份潮濕多雨季節(jié)發(fā)生嚴重，發(fā)病率達到30%[24]；此外，由該菌引起的水稻枯萎病與根腐病近年來也被首次報道[5]。 果蔗種植地區(qū)水量豐富，壟旁的水渠長期處于滿水狀態(tài)，農戶常施大水大肥，這也可能為病原菌的生存繁殖提供了有利條件。 因此，對于F. commune如何在水中或水量豐富地區(qū)繁殖以及侵染水生植物或水量豐富地區(qū)作物的致病機理還有待進一步研究。

本試驗通過對病原菌的鑒定及生物學特性的研究，確定F. commune為果蔗根腐病的致病菌，為病害防治和病原菌的研究提供了理論依據(jù)。 目前對于該病原菌侵染果蔗的流程、致病機理以及病原菌與寄主互作的機制還尚不明確。 后期需進一步探究高效的化學防治方法以及時應對果蔗根腐病的流行與發(fā)生，以期為病害的防治及高抗品種選育與栽培提供指導。