唐富琴，任梅影，朱 雨，蹇 朝，肖穎彬

400037 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院心血管外科，全軍心血管外科研究所，血管損傷與修復(fù)軍隊(duì)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室

心導(dǎo)管評(píng)估小鼠心功能是最準(zhǔn)確和有效的手段，已成為明確小鼠心臟功能表型的標(biāo)準(zhǔn)方法。麻醉劑的使用可使動(dòng)物在心導(dǎo)管操作期間保持鎮(zhèn)靜，易于操作，但麻醉劑可能對(duì)心血管功能存在較為顯著的影響。目前實(shí)驗(yàn)中常用麻醉劑包括腹腔注射氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)、三溴乙醇(tribromoethanol)、巴比妥類(barbiturates)或吸入性麻醉劑，如異氟烷(isoflurane)。這些藥物具有不同的藥理學(xué)特征，在小鼠麻醉過(guò)程中產(chǎn)生不同的心血管效應(yīng)。近年來(lái)研究多關(guān)注麻醉劑對(duì)正常小鼠心功能的影響，但對(duì)心臟疾病模型小鼠心功能檢測(cè)的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探討不同麻醉劑對(duì)心衰小鼠心功能檢測(cè)的影響，研究結(jié)果有助于為心衰模型小鼠心功能評(píng)估實(shí)驗(yàn)中麻醉劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供(AMUWEC20201478)，所有操作程序符合陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求及使用指南。選用8周齡、體質(zhì)量20～25 g的雄性C57/BL6小鼠120只，隨機(jī)分為2部分，每部分60只，實(shí)驗(yàn)小鼠置于聚丙烯籠子中(每只籠子5只小鼠)，并提供食物和水，每天保持12 h的暗光周期。根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)總結(jié)設(shè)置麻醉劑的濃度，戊巴比妥鈉：1.0%水溶液；三溴乙醇：1.2%水溶液；異氟烷：4.5%麻醉誘導(dǎo)，2.0%維持麻醉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)分為2部分。第一部分共60只小鼠，隨機(jī)分為4組，每組15只小鼠，其中主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)10只，主動(dòng)脈弓縮窄假手術(shù)組(Sham組)5只。第一組異氟烷吸入麻醉(2.0%體積分?jǐn)?shù))，第二組腹腔注射三溴乙醇(0.2 mL/10 g)，第三組腹腔注射戊巴比妥鈉(0.05 mL/10 g)，第四組氯胺酮(0.016 mL/10 g)。

第二部分共60只小鼠，隨機(jī)分為9組；第1～3組，每組4只，行主動(dòng)脈弓縮窄假手術(shù)，分別用濃度為2%、4%、6%的異氟烷麻醉；第4～6組，每組8只，行主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，分別用濃度為0.20 mL/10 g、0.18 mL/10 g、0.15 mL/10 g三溴乙醇麻醉；第7～9組，每組8只，行主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，分別用濃度為1.0%、1.5%和2.0%(體積分?jǐn)?shù))的異氟烷進(jìn)行麻醉。比較不同麻醉劑不同劑量下小鼠心功能的變化。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

主動(dòng)脈弓縮窄模型：C57/BL6小鼠(體質(zhì)量20～25 g；年齡8～10周)異氟烷麻醉誘導(dǎo)后，放置于溫度可控的動(dòng)物恒溫毯上。氣管插管連接呼吸機(jī)(呼吸頻率120次/min，潮氣量0.2 mL/次)。將小鼠仰臥固定后，胸前正中切開皮膚，上至胸骨上窩，下至第二肋骨水平。用顯微鑷分離胸腺暴露主動(dòng)脈弓，并游離出右頸總動(dòng)脈，以27 G針頭直徑縮窄主動(dòng)脈弓，建立主動(dòng)脈弓縮窄小鼠模型。操作完成后逐層關(guān)胸，縫皮，關(guān)閉麻醉。術(shù)后每只小鼠皮下注射0.5 mL生理鹽水補(bǔ)充血容量。待小鼠恢復(fù)自主呼吸后脫機(jī)拔管。Sham組開胸后不做結(jié)扎。所有小鼠飼養(yǎng)8周。觀測(cè)小鼠心臟體質(zhì)量比和心臟射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)。

心導(dǎo)管測(cè)定心功能：將小鼠置于10倍解剖放大顯微鏡(德國(guó)萊卡體式顯微鏡M80)下行顯微手術(shù)操作以監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓力。分離并暴露右頸總動(dòng)脈，5-0絲線結(jié)扎近心端和遠(yuǎn)心端，眼科剪在動(dòng)脈上剪一小口，Millar導(dǎo)管從開口處進(jìn)入右頸總動(dòng)脈，打開近心端結(jié)扎線，將導(dǎo)管送入左心室，檢測(cè)器上顯示出壓力容積信號(hào)，固定導(dǎo)管。觀察波形和壓力-容積環(huán)的形態(tài)，記錄左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dt max)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和左心室收縮末期壓力(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)。使用肝素生理鹽水，以防止動(dòng)脈線凝血并維持血容量。

麻醉誘導(dǎo)時(shí)間和蘇醒時(shí)間的定義：①當(dāng)小鼠麻醉給藥后即開始計(jì)時(shí)，為T0；②小鼠麻醉后仰臥體位下心跳及呼吸均勻，肌肉松弛，四肢無(wú)活動(dòng)，胡須無(wú)觸碰反應(yīng)，踏板反射消失，即視為達(dá)到完全麻醉狀態(tài)，此時(shí)為T1；③小鼠完全麻醉后，若小鼠的前肢開始抖動(dòng)，即判定為開始復(fù)蘇，此時(shí)為T2。麻醉誘導(dǎo)時(shí)間= T1-T0，蘇醒時(shí)間=T2-T0。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠壓力負(fù)荷模型構(gòu)建與鑒定

主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)構(gòu)建小鼠壓力負(fù)荷下心力衰竭模型是一種較為經(jīng)典的小鼠心衰模型。小鼠TAC術(shù)后8周，心臟代償性肥大(圖1A)，心功能顯著下降與Sham組相比，TAC術(shù)后8周小鼠心臟體質(zhì)量比顯著增加(

P

<0.01)，見圖1B。心臟射血分?jǐn)?shù)顯著降低(

P

<0.01)，見圖1C。

A：心衰小鼠(右)與正常小鼠(左)心臟大??；B：兩組小鼠心臟/身體質(zhì)量比 a：P<0.05，與Sham組比較；C：兩組小鼠的EF值 a：P<0.05，與Sham組比較

2.2 不同麻醉劑對(duì)TAC和Sham小鼠麻醉效果的比較

異氟烷吸入性麻醉的誘導(dǎo)時(shí)間最短，10～20 s即可進(jìn)入麻醉狀態(tài)。Sham組小鼠的異氟烷誘導(dǎo)時(shí)間為(18.20±3.11)s，TAC組小鼠的異氟烷誘導(dǎo)時(shí)間為(19.10±3.96)s，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A。與異氟烷吸入性麻醉相比，其他幾種腹腔注射的麻醉藥物的誘導(dǎo)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，但其在正常小鼠和心衰小鼠中的誘導(dǎo)時(shí)間均無(wú)顯著差異，見圖2A。在進(jìn)行心導(dǎo)管測(cè)量過(guò)程中，導(dǎo)管進(jìn)入右側(cè)頸總動(dòng)脈后記錄頸動(dòng)脈壓力，心衰小鼠麻醉后的壓力為(93±10)mmHg(收縮壓)、(62±8)mmHg(舒張壓)(不同麻醉方式下，頸動(dòng)脈壓力無(wú)顯著差異)。對(duì)心衰小鼠麻醉時(shí)，按照既往參考劑量易導(dǎo)致心衰小鼠在麻醉過(guò)程中出現(xiàn)死亡：異氟烷組10%(10只小鼠有1只死亡)，三溴乙醇組30%(10只小鼠有3只死亡)，戊巴比妥鈉組40%(10只小鼠有4只死亡)，氯胺酮組30%(10只小鼠有3只死亡)。心衰小鼠麻醉后的蘇醒時(shí)間明顯延長(zhǎng)。停用異氟烷后，心衰小鼠的清醒時(shí)間為(19.70±4.06)min，顯著高于Sham組的清醒時(shí)間(

P

<0.05)。幾種腹腔注射的麻醉藥物也不同程度延長(zhǎng)了心衰小鼠麻醉后清醒時(shí)間(

P

<0.05)，見圖2B。

A：不同麻醉劑誘導(dǎo)時(shí)間的比較；B：不同麻醉劑清醒時(shí)間的比較 a：P<0.05，與Sham組比較

2.3 不同麻醉劑對(duì)TAC組小鼠和Sham組小鼠的心率和心功能的影響

Sham組小鼠用異氟烷麻醉后，其心率和心功能均發(fā)生不同程度的變化。分別用2%、4%、6%的濃度進(jìn)行麻醉，隨著麻醉劑量的增加，小鼠心功能指標(biāo)顯著下降(圖3)。

圖3 不同濃度的異氟烷麻醉Sham組小鼠的左心室壓力-容積環(huán)

Sham組小鼠麻醉30 min后，其心率和心功能與麻醉早期(10 min)無(wú)顯著差異(

P

>0.05，圖4A、B)。但是，在心衰小鼠麻醉中，戊巴比妥鈉和氯胺酮顯著降低了小鼠麻醉30 min后的心率(

P

<0.05，圖4C)。與之相比，異氟烷吸入麻醉和三溴乙醇腹腔注射麻醉的TAC組小鼠，在麻醉過(guò)程中心率變化無(wú)差異(

P

>0.05)。戊巴比妥鈉和氯胺酮麻醉的心衰小鼠其心臟射血分?jǐn)?shù)在麻醉后期(30 min)顯著降低；而異氟烷吸入麻醉和三溴乙醇腹腔注射麻醉的心衰小鼠EF值變化不明顯(圖4D)。

A：不同麻醉劑對(duì)Sham組小鼠心率影響的比較；B：不同麻醉劑對(duì)Sham組小鼠心功能影響的比較；C：不同麻醉劑對(duì)TAC組小鼠心率影響的比較 a：P<0.05，與Sham組比較；D：不同麻醉劑對(duì)TAC組小鼠心功能影響的比較 a：P<0.05，與Sham組比較

2.4 評(píng)估不同麻醉劑量對(duì)小鼠心導(dǎo)管結(jié)果的影響

為進(jìn)一步觀察TAC組小鼠在心導(dǎo)管檢測(cè)時(shí)的最佳麻醉方式和麻醉劑量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)異氟烷和三溴乙醇進(jìn)行了不同劑量的比較。異氟烷麻醉組，2.0%的濃度和1.5%濃度可以降低TAC組小鼠麻醉過(guò)程中的EF值，但當(dāng)異氟烷濃度調(diào)整為1.0% 時(shí)，心衰小鼠EF值在麻醉過(guò)程中無(wú)明顯變化(

P

>0.05)，見圖5A。腹腔注射三溴乙醇組，0.15 mL/10 g的麻醉劑量可以較好地維持TAC組小鼠麻醉過(guò)程中的EF值，見圖5B。

A：不同濃度異氟烷對(duì)TAC組小鼠心功能影響的比較；B：不同濃度三溴乙醇劑對(duì)TAC組小鼠心功能影響的比較

3 討論

心導(dǎo)管檢測(cè)是精確評(píng)估小鼠心功能的一種有創(chuàng)技術(shù)。具有數(shù)據(jù)精確可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。研究表明麻醉劑劑量與小鼠心功能密切相關(guān)，于心衰小鼠而言，因其心功能下降，更容易受到麻醉劑的影響，相關(guān)研究鮮有報(bào)導(dǎo)。本文選擇4種不同的麻醉劑，觀察其對(duì)心衰小鼠心功能的影響。研究結(jié)果顯示，吸入異氟烷是小鼠心導(dǎo)管檢測(cè)期間較安全穩(wěn)定的麻醉劑。1.5% v/v劑量的異氟烷在心衰小鼠中可以維持小鼠血壓和心率平穩(wěn)。腹腔注射三溴乙醇麻醉也有較好的麻醉效果，但在心力衰竭小鼠中，腹腔注射三溴乙醇存在安全性問(wèn)題。既往文獻(xiàn)的推薦劑量容易導(dǎo)致心衰小鼠死亡。因此，對(duì)于心衰小鼠的麻醉，吸入性異氟烷可能是較好的選擇。

3.1 麻醉劑對(duì)小鼠心臟功能的影響

實(shí)驗(yàn)中常用的麻醉劑對(duì)小鼠心臟功能都有一定影響，不同程度地抑制心功能，但不同麻醉劑的抑制程度不同。既往研究選用清醒小鼠作為對(duì)照，研究麻醉劑對(duì)小鼠心功能的抑制，但在小鼠清醒狀態(tài)下直接抓持，其本身會(huì)引起小鼠交感神經(jīng)興奮，導(dǎo)致小鼠心率過(guò)快，檢測(cè)結(jié)果并非小鼠靜息心功能。因此，本研究中未設(shè)置清醒小鼠作為對(duì)照，心衰小鼠的心功能較差，過(guò)大的刺激會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡。同時(shí)部分小鼠在清醒狀態(tài)下，心率和心功能變化較大，穩(wěn)定性較差。心導(dǎo)管檢測(cè)心功能也受操作者技術(shù)的影響，實(shí)驗(yàn)中存在數(shù)次因?qū)Ч芊胖梦恢貌粶?zhǔn)確，小鼠出現(xiàn)心率異?，F(xiàn)象，需要停止操作，待其恢復(fù)平靜后繼續(xù)測(cè)量。此外，影響心率的因素眾多，選擇合理的麻醉藥物，實(shí)現(xiàn)滿意的麻醉鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，可以抑制交感神經(jīng)，減慢心律，減少抓取或手術(shù)疼痛導(dǎo)致的交感神經(jīng)興奮，一定程度上排除了植物神經(jīng)對(duì)心率的干擾。本研究在保證小鼠完全麻醉的情況下檢測(cè)心率，發(fā)現(xiàn)不同的麻醉藥物均會(huì)導(dǎo)致小鼠心率有一定程度的減慢，這一現(xiàn)象在心衰小鼠模型中尤為明顯。因此，本研究組認(rèn)為，在麻醉小鼠的過(guò)程中，選擇對(duì)小鼠心率影響越小的麻醉藥物，可能更適合應(yīng)用于心衰模型小鼠心功能檢測(cè)。

3.2 不同麻醉劑量對(duì)小鼠心臟功能的影響

本研究組選擇參考文獻(xiàn)推薦的劑量，不同麻醉劑都有一定的使用劑量范圍。既往數(shù)據(jù)表明，4種麻醉劑的推薦用量為：異氟烷吸入麻醉(2.0%體積分?jǐn)?shù))或腹腔注射三溴乙醇(1.25%，0.2 mL/10 g)或腹腔注射戊巴比妥鈉(1%，0.05 mL/10 g)或氯胺酮(5%，0.016 mL/10 g)，在實(shí)驗(yàn)中觀察到，即使對(duì)于同一種麻醉劑，當(dāng)使用劑量小于推薦劑量時(shí)，雖然可以實(shí)現(xiàn)足夠的鎮(zhèn)靜作用，但是鎮(zhèn)痛效果差。如果增加麻醉劑量雖可以提供足夠的鎮(zhèn)痛作用，但是與之相關(guān)的死亡率風(fēng)險(xiǎn)和血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性增加。針對(duì)同種麻醉劑梯度劑量影響的研究結(jié)果顯示：對(duì)于心功能較差的小鼠而言，適度減低麻醉劑用量，可以保證小鼠麻醉過(guò)程中的安全。

3.3 研究的不足之處

在評(píng)估麻醉藥物對(duì)小鼠的致死率時(shí)，研究所納入的樣本量偏少，這可能導(dǎo)致死亡率的統(tǒng)計(jì)分析存在一定程度的偏倚。通過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)的觀察及驗(yàn)證，在本實(shí)驗(yàn)所使用的麻醉劑量下，4種麻醉劑導(dǎo)致心衰小鼠死亡率都在可接受范圍內(nèi)。在后續(xù)的研究中，將增大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)：異氟烷吸入使用便捷，參數(shù)穩(wěn)定性好，更適于心衰小鼠心功能檢測(cè)。既往亦有多項(xiàng)研究證實(shí)異氟烷吸入麻醉更適于小鼠有創(chuàng)實(shí)驗(yàn)。由于不同麻醉劑對(duì)心功能影響程度不同，對(duì)多種參數(shù)的影響程度也不同，因此實(shí)際操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要謹(jǐn)慎選擇麻醉劑，并在同一實(shí)驗(yàn)中保持前后麻醉劑選擇一致，麻醉劑量及條件一致，最大程度避免因麻醉劑而產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差。

綜上所述，對(duì)于壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心衰模型小鼠的麻醉，異氟烷吸入的安全性高，對(duì)心功能的影響小，明顯優(yōu)于其他麻醉劑。