薛海波，張潔菡，吳凡，王澤雨津，楊凰伶，謝琳，金思洋，彭英云，楊治風，陳義勇

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.江蘇梁豐食品集團有限公司，江蘇張家港 215623；3.張家港市畜牧獸醫(yī)站，江蘇張家港 215600）

0 引 言

晚期糖基化末端產物( advanced glycation endproducts，AGEs)是在食品加工和貯藏過程中，通過美拉德反應生成的一類不可逆的共價化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)一些疾病如糖尿病及其并發(fā)癥[2]、動脈硬化[3]、腎功能障礙[4]、心血管疾病[5]等是由AGEs 引起的。在食品熱加工過程中，如巴氏殺菌、高溫殺菌、烘烤和油炸等過程容易形成AGEs[6]。因此如何控制食品加工過程中AGEs 形成顯得尤為重要。

UHT 奶經過超高溫瞬時滅菌后，具有常溫貯存時間長、銷售方便的優(yōu)點[7]。但是UHT 奶加工和貯藏過程中會產生對人體有害的產物AGEs，如何降低UHT 奶加工過程中產生的AGEs 是急需解決的問題。近年來，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物除具有較好抗氧化作用外，同時具有顯著抗糖基化活性，如芹菜素、蘆丁、沙棘籽渣黃酮、玉米須黃酮等黃酮類物質對AGEs 具有較高抑制作用[8]，但是黃酮類物質應用于乳制品生產過程中的AGEs 的抑制作用未見報道。針對UHT 奶在生產和貯藏過程中AGEs 的形成因素及控制鮮見報道的現(xiàn)狀，本研究以UHT 奶為對象，以UHT 奶中熒光性AGEs 含量為指標，考查加工條件（糖種類、糖添加量）、貯藏條件（溫度和時間）以及添加食源性黃酮（槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素）對UHT 奶生產和貯藏過程中AGEs 形成的影響，以期控制UHT 奶生產和貯藏過程中的AGEs，旨在為UHT奶的安全生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳，江蘇梁豐食品集團有限公司提供；槲皮素、蘆丁、染料木素、兒茶素，陜西秦邦藥業(yè)有限公司；磷酸氫二鈉，上海國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖、果糖、葡萄糖、果葡糖漿，鄭州百思特食品添加劑有限公司；蔗糖脂肪酸酯、單甘油脂肪酸酯，廣州立勝貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

RT-6000 酶標儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司；AH-BASIC 均質機，安拓思納米技術（蘇州）有限公司；TG16-WS 高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Agilent LC-MS，美國安捷倫公司；HS-150 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；超高溫瞬時殺菌系統(tǒng)，上海沃迪智能裝備股份有限公司；pH 計，瑞士METTLER TOLEDO 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 UHT 奶的制備流程

1.3.2 熒光性AGEs 含量的測定

根據(jù)文獻[9]的方法進行熒光性AGEs 含量的測定。將2 mL UHT 奶和4 mL 甲醇混勻后在-80 ℃的條件下保存1 h，然后離心（1 3000 r/min，30 min），取0.3 mL上清液，在λex/λem=340 nm/465 nm 波長處測定熒光值,λex為熒光激發(fā)波長340nm 處的熒光值；λem為熒光發(fā)射波長465 nm 處的熒光值。以磷酸鹽緩沖溶液作為對照，每組樣品重復3 次。

1.3.3 糖種類對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

原料奶經過檢驗后過濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯），然后分別加入添加量為2%的果糖、蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿，充分混勻后，經過過濾均質，然后在137 ℃條件下進行UHT 殺菌，殺菌時間4 s，然后取UHT 奶樣品按照1.3.2 節(jié)的方法測定熒光性AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對照組，每組樣品重復3 次。

1.3.4 糖添加量對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs的影響

原料奶經過檢驗后過濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯），然后分別加入添加量為2%、4%、6%、8%的蔗糖，充分混勻后，經過過濾均質，然后在137 ℃條件下進行UHT 殺菌，殺菌時間4 s，然后取UHT 奶樣品按照1.3.2 節(jié)的方法測定熒光性AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對照組，每組樣品重復3 次。

1.3.5 貯藏溫度和時間對UHT 奶中熒光性AGEs 的影響

原料奶經過檢驗后過濾、冷卻、貯存，然后加入0.3%的復配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混勻后，經過過濾均質，然后在137 ℃條件下進行UHT 殺菌，殺菌時間4 s，滅菌完成后取出冷卻至室溫。將UHT 奶分別貯藏在4、25 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱中，于0、5、15、30、60 d 后取樣，樣品按1.3.2 節(jié)的方法測定AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對照組，每組樣品重復3 次。

1.3.6 黃酮對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

原料奶經過檢驗后過濾、冷卻、貯存，然后加入0.3%的復配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混勻后，然后加入質量分數(shù)分別為4、6 和8%的槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素，經過過濾均質，然后在137 ℃條件下進行UHT 殺菌，殺菌時間4 s，然后取UHT 奶樣品按照1.3.2 節(jié)的方法測定熒光性AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對照組，每組樣品重復3 次。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)進行3 次平行試驗取平均值，以“平均值±標準差”表示，作圖采用Origin8.0 軟件，利用spss20 軟件處理數(shù)據(jù)軟件進行方差分析和統(tǒng)計學分析（P＜0.05 表示存在統(tǒng)計學差異）。

2 結果與討論

2.1 糖種類對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

糖種類對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響結果見圖1。從圖1 可以看出，不同糖對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響較大。與蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿相比，果糖對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的生成起到明顯的促進作用（P＜0.05），蔗糖對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的生成的促進作用最?。≒＜0.05），有利于降低AGEs 的生成。這4 種糖對AGEs 的生成促進作用由大到小依次為果糖、葡萄糖、果葡糖漿和蔗糖，促進AGEs 的生成的原因是因為單糖、低聚糖等受熱自身發(fā)生焦糖化反應，產生丙酮醛（methylglyoxal，MGO），糖自身發(fā)生羥醛縮合和自氧化生成乙二醛（glyoxal，GO）[10]。MGO 和GO 又進一步與蛋白質結合，通過系列反應生成戊糖素、類黑素以及羧甲基賴氨酸等AGEs[11]。因此，本實驗中的糖原料中單糖比如葡萄糖、果糖和果葡糖漿與蔗糖相比，更易發(fā)生糖基化反應形成熒光性AGEs，因此為了減少熒光性AGEs 的生成，蔗糖適宜作為UHT 奶加工過程中的糖原料。

圖1 糖種類對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

2.2 糖添加量對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

在確定蔗糖作為適宜生產UHT 奶的原料的基礎上，需要確定蔗糖合適的添加量。蔗糖添加量對UHT奶生產過程中熒光性AGEs 的影響見圖2，從圖2 可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量逐步增高。當蔗糖添加量在0%～4%范圍時，隨著蔗糖添加量的增加，熒光性AGEs 生成量明顯增加（P＜0.05），原因可能是隨著糖添加量的增加，促進了蛋白糖基化反應。當蔗糖添加量在4%～8%范圍時，隨著蔗糖添加量的增加，熒光性AGEs 生成量有一定程度的增加，但是增加不明顯（P＞0.05）?？赡苁且驗殡S著蔗糖添加量（大于4%）進一步增加，形成熒光性AGEs 的量呈現(xiàn)基本飽和狀態(tài)，進而達到最高值[12]。因此適宜的蔗糖添加量為2%。

圖2 蔗糖添加量對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

2.3 貯藏溫度和時間對UHT 奶中熒光性AGEs 的影響

貯藏溫度和時間對UHT 奶中熒光性AGEs 的影響見表1，從表1 可以看出，UHT 奶在貯藏60 d 內，熒光性AGEs 生成量隨著貯藏溫度的提高及貯藏時間的延長而增加。貯藏期在30 d 內，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量隨著貯藏溫度的提高及貯藏時間的延長差異顯著（P＜0.05）。在相同貯藏時間、溫度不同條件下，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量差異顯著（P＜0.05）。在4、25 ℃和37 ℃條件下，15 d 內熒光性AGEs 生成量增幅較大，貯藏時間超過15 d，熒光性AGEs 生成量變化不大。25 ℃和37 ℃條件下，貯藏期為30 d 時，UHT 奶中熒光性AGEs 形成量分別是4 ℃條件下的1.07 倍和1.13 倍。原因可能是貯藏溫度越高，促進了UHT 奶中糖類物質發(fā)生羥醛縮合，促進脂肪發(fā)生氧化，使得生成更多的1,2-二羰基化合物，導致產生越多的AGEs[13]。隨著溫度增加AGEs 產量差值增加量逐漸減小，是因為溫度升高生成AGEs 所需的底物越來越少，溫度增加導致AGEs 生成量增加不明顯。由此，UHT 奶低溫存放更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs 的生成。

表1 貯藏溫度對UHT 奶中熒光性AGEs 的影響

2.4 黃酮對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

黃酮對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響見表2，從表2 可以看出，隨著黃酮添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量顯著減少（P＜0.05）。4種黃酮對降低熒光性AGEs 的生成的效果排序為：蘆?。鹃纹に兀救玖夏舅兀緝翰杷?。以蘆丁為例，當添加量由4%增加到8%時，熒光性AGEs 的生成量降低了40.7%。黃酮能夠抑制UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的生成，可能是因為黃酮能夠結合中間產物1,2-二羰基化合物，從而阻斷由1,2-二羰基化合物介導生成AGEs 的路徑，另外可能是因為黃酮具有抗氧化作用，從而通過抗氧化作用阻斷由自由基引發(fā)的合成AGEs 的路徑[14-16]。

表2 黃酮對UHT 奶生產過程中熒光性AGEs 的影響

（續(xù)表2）

3 結 論

本文以UHT 奶生產過程中晚期糖基化末端產物調控為核心，闡明了在UHT 奶生產過程中，糖（包括糖種類、糖添加量）、貯藏條件（溫度和時間）以及添加食源性黃酮（槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素）對UHT 奶中AGEs 生成的影響，結果表明糖對AGEs 的生成促進作用由大到小依次為果糖、葡萄糖、果葡糖漿和蔗糖，為了減少熒光性AGEs 的生成，蔗糖適宜作為UHT 奶加工過程中的糖原料。隨著蔗糖添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量逐步增高。因此，在UHT 奶加工過程中，減少糖的添加量可以大大減少熒光性AGEs 的形成。適宜的蔗糖添加量為2%。UHT 奶低溫貯藏（4 ℃）、減少貯藏時間（貯藏時間不易超過15 d，）更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs的生成。在UHT 奶加工過程中，食源性黃酮具有明顯的抑制AGEs 的生成，并且隨著黃酮添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量顯著減少（P＜0.05）。4 種黃酮對降低熒光性AGEs 的生成的效果排序為：蘆?。鹃纹に兀救玖夏舅兀緝翰杷?。蘆丁具有較好的抗糖化作用，適宜作為一種UHT 奶貯藏過程中天然有效的AGEs 抑制劑。

該研究聚焦UHT 奶生產過程中晚期糖基化末端產物調控，闡明了影響UHT 奶生產過程中影響熒光性AGEs 生成的影響因素，從而為有效調控UHT 奶生產和貯藏過程中有害物質的產生，為UHT 奶的安全生產提供了參考。