付新，鄧琦川，張佳寧，?；?/p>

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種嚴(yán)重?fù)p害老年人健康的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以漸進(jìn)性記憶減退、顯著性語(yǔ)言功能障礙、加劇性認(rèn)知功能缺陷以及人格行為改變等為主要特征，最終導(dǎo)致重度癡呆、智力全面下降等嚴(yán)重癥狀。目前普遍認(rèn)為，阿爾茨海默病在神經(jīng)病理學(xué)上存在兩種經(jīng)權(quán)威證據(jù)證實(shí)的主要特征：β 淀粉樣蛋白（β amyloid，Aβ）沉積和攜帶APOE e4 等位基因［1］。調(diào)查阿爾茨海默病的患病情況可以發(fā)現(xiàn)，患有AD 的人數(shù)隨著世界人口老齡化程度的加劇而不斷增加。據(jù)《世界阿爾茨海默病報(bào)告2018》估計(jì)，到2050 年，全球患阿爾茨海默病的人數(shù)將增至1.52 億［2］。由于AD 改變了一系列分子細(xì)胞進(jìn)程，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病原因多樣，目前為止尚未找到合適的治療方案。盡管不斷開發(fā)新的治療藥物，但只能減緩癥狀，并不能有效地治愈AD，無(wú)法改變其病理進(jìn)程［3］。因此，研發(fā)預(yù)防、緩解及治療AD 的藥物具有極為重要的臨床價(jià)值。

中醫(yī)藥具有“多活性成分－多靶點(diǎn)－多通路－多疾病”的治療特點(diǎn)，契合AD 發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和病因的多樣性，以及其改變一系列分子細(xì)胞進(jìn)程的特征，通過(guò)探討兩者潛在的協(xié)同效應(yīng)，以此挖掘中醫(yī)藥同時(shí)靶向多種AD 相關(guān)靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)［4］。牛黃是一種常用的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為?？苿?dòng)物牛的干燥膽結(jié)石［5］，在許多中醫(yī)著作中，用于治療與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，臨床應(yīng)用已有兩千多年的歷史。基于大量藥理學(xué)及藥效學(xué)研究證實(shí)，牛黃對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有顯著作用，主要包括鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗癲癇、抗腦損傷、保護(hù)腦血管、解熱鎮(zhèn)痛以及通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育和增殖分化以增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的作用［6］。此外，相關(guān)藥理學(xué)研究表明，牛黃可與多味中藥配伍制成復(fù)方藥劑，用于醫(yī)治中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，如神經(jīng)重癥等［7］。近年來(lái)，研究者們不斷對(duì)牛黃的活性成分、作用靶點(diǎn)以及相關(guān)作用機(jī)制等進(jìn)行研究探討，權(quán)威研究結(jié)果顯示，牛黃可能對(duì)AD 等一系列神經(jīng)性疾病有良好的預(yù)防與治療作用［8］。因此，牛黃有望成為預(yù)防及治療AD 的生物活性藥物，對(duì)其進(jìn)行深入研究具有極大臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分的獲得、檢索及主要活性成分的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)庫(kù)和專業(yè)分析平臺(tái)（TCMSP），以中藥牛黃為檢索詞，得到牛黃的全部活性成分及化學(xué)成分作用靶點(diǎn)，根據(jù)TCMSP 初步篩選標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定口服利用度（oral bioavailability，OB）≥15%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為初步篩選參數(shù)，并結(jié)合已有的藥理學(xué)研究收集符合條件的有效成分。此外，通過(guò)中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)（CNKI，https：//kns. cnki.net/），主題檢索2015 年1 月1 日—2020 年12 月1 日文獻(xiàn)中牛黃的化學(xué)成分。通過(guò)生物醫(yī)學(xué)和健康科學(xué)信息檢索系統(tǒng)PubMed（https：//pubmed. ncbi. nlm.nih.gov/）以牛黃的化學(xué)成分為主要關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，根據(jù)已發(fā)表的藥物相關(guān)成分的文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)充有效活性成分及其預(yù)測(cè)的相關(guān)靶點(diǎn)，并結(jié)合TCMSP 得到的相關(guān)靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. uniprot. org）將靶蛋白轉(zhuǎn)換成為基因，并剔除非人源基因。

1.2 阿爾茨海默病的相關(guān)靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，同時(shí)為保證研究數(shù)據(jù)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性及全面性，以“Alzheimer's Disease”“Alzheimer disease”“Senile Dementia”“AD”等阿爾茨海默病相關(guān)名詞作為檢索詞，分別獲取AD 的核心作用靶點(diǎn)。利用Draw Venn Diagram 在線繪圖工具平臺(tái)將各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)基因取并集，并繪制AD 疾病基因韋恩圖。

1.3 牛黃有效成分－AD疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein－protein interaction，PPI）是指從蛋白質(zhì)分子層面深入挖掘化合物和疾病兩者之間的相關(guān)性，再?gòu)幕A(chǔ)生物化學(xué)，相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子遺傳網(wǎng)絡(luò)等角度構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)以研究相關(guān)性。為更加明確闡述其靶蛋白在分子系統(tǒng)水平上的主要作用，將上述獲得的主要靶點(diǎn)于STRING 11. 0 數(shù)據(jù)庫(kù)在線上傳，物種篩選為“智人”，同時(shí)設(shè)置靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的置信度為0. 40，以獲得PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.4 生物信息學(xué)注釋

將牛黃核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 主要通路分析。使用生物化學(xué)在線基因信息學(xué)功能注釋專業(yè)分析工具M(jìn)etascape（http：//metascape. org/），以P< 0.05 為初步篩選條件，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行平臺(tái)在線KEGG 通路富集分析，并對(duì)得到的氣泡圖和柱狀圖進(jìn)行分析。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶蛋白的相應(yīng)3D 結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)受體與主要配體的獲取方法如下：

醛糖還原酶的三維晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于Protein Database（PDB 代號(hào)為1US0）。中藥牛黃的主要活性成分（共計(jì)3 種小分子化合物）的SDF 文件全部來(lái)源于PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通 過(guò)將從成分－靶點(diǎn)－疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)圖中找出的3 種主要化學(xué)成分輸入PubChem 中，以SDF 形式下載其3D Conformer 并保存在文件夾中，由此獲得主要配體的3D 模型。阿爾茨海默病的蛋白質(zhì)受體的3D 模型主要通過(guò)PDB（https：//www. rcsb. org/）這一網(wǎng)址進(jìn)行搜索，首先排除非人的靶點(diǎn)，再以從最好到最壞的方式將其A 值進(jìn)行排列（A 值越小，蛋白質(zhì)受體越好），通過(guò)下載其PDF格式，便可獲得蛋白質(zhì)受體不同類型的3D模型。接下來(lái)便可通過(guò)CB－Dock 軟件將蛋白質(zhì)受體與主要成分配體進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 牛黃的活性成分篩選

通過(guò)在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索牛黃，獲取牛黃的全部化學(xué)成分共133 種。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)篩選條件，得到活性成分共計(jì)13 個(gè)，其中具有中強(qiáng)度滲透性的活性成分有3 種，不透過(guò)BBB 的活性成分有10 種。見表1。

表1 牛黃的主要活性成分

續(xù)表1

2.2 活性成分的靶點(diǎn)篩選結(jié)果與預(yù)測(cè)

排除各化合物對(duì)應(yīng)的相同靶點(diǎn)后，共對(duì)應(yīng)133個(gè)潛在靶點(diǎn)。其中11個(gè)橙紅色菱形方塊節(jié)點(diǎn)表示有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的牛黃活性成分，周圍的133個(gè)藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)表示活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白，即潛在的藥物靶點(diǎn)，邊緣表示交互作用，節(jié)點(diǎn)的大小與程度成正比，繪制結(jié)果見圖1。

圖1 牛黃活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的復(fù)合目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.3 AD相關(guān)病理靶點(diǎn)的篩選

TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到AD 相關(guān)靶點(diǎn)156 個(gè)；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到AD 初始靶點(diǎn)11 207 個(gè)，以≥1.5為篩選條件得到AD 相關(guān)靶點(diǎn)7 214個(gè)；OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到377 個(gè)相關(guān)結(jié)果后刪除重復(fù)靶點(diǎn)得到AD相關(guān)靶點(diǎn)200個(gè)；DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到AD相關(guān)靶點(diǎn)99 個(gè)。對(duì)各個(gè)基礎(chǔ)工具檢索的結(jié)果進(jìn)行合并，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到10 437 個(gè)AD 相關(guān)靶點(diǎn)，繪制的Venn圖結(jié)果見圖2。

圖2 篩選AD相關(guān)靶點(diǎn)的Venn圖

2.4 牛黃活性成分－AD共同靶點(diǎn)的篩選及構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)

將篩選后獲取的133 個(gè)藥物靶點(diǎn)與10 437 個(gè)疾病靶點(diǎn)上傳至在線繪圖工具平臺(tái)Cytoscape，找出交集靶點(diǎn)共4 個(gè)，并將靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖顯示共有23 個(gè)節(jié)點(diǎn)，97 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為8.43，見圖3。其中節(jié)點(diǎn)表示相關(guān)蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用。

圖3 靶標(biāo)蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 牛黃活性成分治療AD關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG通路富集分析結(jié)果

為了討論牛黃對(duì)AD 作用的分子機(jī)制，我們通過(guò)KOBAS 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)牛黃活性成分與疾病的5 個(gè)交集基因CHRM3、CHRM1、CCND2、MTTP、BCL2進(jìn)行了KEGG 富集通路分析。選擇每個(gè)聚類富集率最高且P值< 0. 05 的5 條通路，并將得到的通路進(jìn)行可視化，見圖4、表2。圖中縱坐標(biāo)表示KEGG 富集所得的通路，橫坐標(biāo)表示負(fù)的P值的對(duì)數(shù)。

圖4 富集分析通路圖

表2 5個(gè)交集基因的KEGG通路富集結(jié)果

分析富集結(jié)果顯示，其可能生物學(xué)進(jìn)程主要包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡［9］、線粒體動(dòng)態(tài)變化分裂與融合［10］、癌癥壞死因子、炎癥介質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子［11］、神經(jīng)元調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡［12］等；信號(hào)通路主要為膽堿能突觸、胃酸分泌、唾液分泌、凋亡－多物種、p53 信號(hào)通路、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、催乳激素信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、細(xì)胞衰老等，以上富集分析數(shù)據(jù)顯示，牛黃的主要成分可能通過(guò)作用于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)通路，如含血清素的膽堿能神經(jīng)突觸等，還對(duì)凋亡－multiple specesp53 信號(hào)通路、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、催乳激素信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、唾液分泌通、胃酸分泌等進(jìn)行調(diào)控，從而發(fā)揮治療AD 的潛在作用。信號(hào)通路的顯著性通過(guò)展示圖中氣泡的大小來(lái)表示，氣泡越大代表富集該通路的基因越多，說(shuō)明該通路在牛黃發(fā)揮治療AD 的作用中越重要。該結(jié)論研究初步揭示牛黃神經(jīng)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)及涉及的信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究其AD 作用機(jī)制提供參考和依據(jù)。

2.6 活性成分－疾病交集基因與通路的網(wǎng)絡(luò)互作圖

橙色的5 個(gè)節(jié)點(diǎn)表示牛黃活性成分與疾病交集基因；外面的圓圈為基因?qū)?yīng)的通路；有深藍(lán)色圈的通路表示P值<0.05且選擇每個(gè)聚類富集率最高的5條的通路。見圖5。

圖5 活性成分－疾病交集基因與通路的網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.7 分子對(duì)接

2.7.1 牛黃活性成分與AD 所對(duì)應(yīng)的靶蛋白的交集——受體

2004 年發(fā)表于PubMed 的超高分辨率藥物設(shè)計(jì)關(guān)于人醛糖還原酶抑制劑復(fù)合物首次提出了一個(gè)36 kDa蛋白質(zhì)的亞原子分辨結(jié)構(gòu)［13］，即醛糖還原酶（P 代號(hào)1S0）。其分辨度為0.66?，該模型總體上非常有序，此外，這個(gè)蛋白模型和電子密度詳細(xì)顯示了較多細(xì)微特征，例如氫原子、鍵密度和標(biāo)磚立體化學(xué)的顯著偏差等。同時(shí)，該模型的氫鍵網(wǎng)絡(luò)、多重構(gòu)想以及溶劑結(jié)構(gòu)也有相對(duì)完善的定義。更為重要的是該模型的活性中心區(qū)域的大部分原子具有極好的有序性，以此可以確定與催化作用有關(guān)的殘基的質(zhì)子化狀態(tài)。以人模型結(jié)構(gòu)1US0 為蛋白受體對(duì)牛黃主要成分及其主要活性小分子進(jìn)行分子對(duì)接，可為研究中藥牛黃對(duì)阿爾茨海默病的作用機(jī)制提供一些參考，故分子對(duì)接選用1US0作為受體。

2.7.2 牛黃活性成分——配體

牛黃為牛科動(dòng)物牛的干燥膽結(jié)石，通過(guò)對(duì)2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》和TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容進(jìn)行整合，得出其主要成分為oleanolic acid、ergosterol、ursolic acid、methyl（4R）－4－［（3R，5S，7S，8R，9S，10S，12S，13R，14S，17R）－3，7，12－trihydroxy－10，13－dimethyl－2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，14，15，16，17－tetradecahydro－1H－cyclopenta［a］phenanthren－17－yl］pentanoate、Methyl desoxycholate、chenodeoxycholic acid、Cherianoi、methyl（4R）－4－［（3R，5S，7R，8R，9S，10S，13R，14S，17R）－3，7－dihydroxy－10，13－dimethyl－2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，14，15，16，17－tetradecahydro－1H－cyclopenta［a］phenanthren－17－yl］pentanoate、Deoxycholic Acid、ZINC01280365 和CLR這11 種［5］，其中能與阿爾茨海默病受體進(jìn)行分子對(duì)接的活性成分只有Cherianoine、ursolic acid、chenodeoxycholic acid 這3種。

2.7.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

根據(jù)成分－疾病－通路網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果，確定關(guān)鍵靶點(diǎn)為 Muscarinic acetylcholine receptor M1、Prostaglandin G/H synthase 2、Neuronal acetylcholine receptor protein，alpha－7 chain、Carboxylesterase 2；關(guān)鍵成分為Cherianoine、ursolic acid、chenodeoxycholic acid。經(jīng)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)四種關(guān)鍵靶點(diǎn)中的蛋白質(zhì)從好到壞進(jìn)行分析提取，發(fā)現(xiàn)能夠與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接的蛋白質(zhì)活性成分均為aldose reductase（醛糖還原酶）。利用CB－Dock軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)中的活性蛋白和關(guān)鍵成分的相互作用進(jìn)行分子對(duì)接預(yù)測(cè)，見圖6。CB-Dock 會(huì)對(duì)每一種預(yù)測(cè)模型進(jìn)行vina值打分，vina值表明化合物與蛋白質(zhì)之間具有一定的結(jié)合活性，vina值越負(fù)，表明該化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合越穩(wěn)定。經(jīng)軟件對(duì)接得出關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白aldose reductase與關(guān)鍵成分的相互作用vina值分別為?6.1、?9、?9、?6.4、?6.4、?9，均≤?6.4，表明aldose reductase 與Cherianoine、ursolic acid、chenodeoxycholic acid之間均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，其中aldose reductase 與ursolic acid、chenodeoxycholic acid 的vina 值均為?9，表明它們的結(jié)合能力最強(qiáng)。牛黃極有可能是通過(guò)其中的活性成分ursolic acid和chenodeoxycholic acid 作用于人體阿爾茨海默病靶點(diǎn)中的aldose reductase結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮治療阿爾茨海默病的作用的。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果示意圖

3 分析與討論

中醫(yī)古籍中沒(méi)有阿爾茨海默病的名稱記載，可被定義為“癡呆”“呆病”“健忘”等，明代張景岳《景岳全書·雜證謨》中最早提出“癡呆”病名。其發(fā)病機(jī)制是五臟虛損為本，痰濁、瘀血邪實(shí)蒙蔽清竅為標(biāo)［14］。牛黃具有清心、化痰、利膽、鎮(zhèn)驚的作用。本研究主要通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子生物學(xué)相互結(jié)合的方法，初步研究探討牛黃治療AD的可能作用靶點(diǎn)及機(jī)制，具體見圖7。

圖7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合代謝組學(xué)構(gòu)建的靶點(diǎn)－基因－通路圖

3.1 潛在有效成分分析

3.1.1 熊果酸

有研究顯示，熊果酸作用于阿爾茨海默病模型后，Aβ25－35處理的細(xì)胞存活率水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率水平降低，Cleaved Caspase－3 蛋白表達(dá)能力下降，MDA、ROS 水平降低，SOD 活性提升，SNHG14表達(dá)降低，miR－105表達(dá)升高（P< 0.05），而SNHG14 過(guò)表達(dá)或干擾miR－105 表達(dá)可降低熊果酸對(duì)Aβ25－35誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞起到保護(hù)作用。因此，熊果酸可能通過(guò)調(diào)控SNHG14/miR－105 分子軸從而抑制Aβ25－35誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡，并減輕細(xì)胞氧化損傷，從而起到對(duì)阿爾茨海默病的預(yù)防作用［15］。

3.1.2 鵝去氧膽酸

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，鵝去氧膽酸具有對(duì)抗DEX 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 凋亡作用，且與上調(diào)凋亡抑制蛋白mRNA 表達(dá)有關(guān)［16］。還可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與激活TGR5、抑制Akt/NF－κB 信號(hào)通路有關(guān)［17］。這些作用均可直接對(duì)阿爾茨海默病的抑制產(chǎn)生影響，從而極大地降低發(fā)病率。

3.2 潛在靶點(diǎn)分析

3.2.1 毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1

毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M 受體）亞型M1 受體（M1R）在腦內(nèi)的分布量極大，且在海馬和大腦皮層中高度表達(dá)，發(fā)揮著舉足輕重的促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的作用，激活M1R 可增強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)間電位（long－time potentiation，LTP）并誘導(dǎo)神經(jīng)元樹突棘頭部絲狀偽足的形成，從而改善神經(jīng)突觸可塑性［18］。通過(guò)對(duì)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶促進(jìn)作用進(jìn)行探索，可能為阿爾茨海默病等認(rèn)知功能障礙疾病的研究和治療提供新的思路和可能的新靶點(diǎn)。

3.2.2 前列腺素G/H合酶

白細(xì)胞介素－1在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要，它的作用可能部分通過(guò)前列腺素介導(dǎo)。前列腺素G/H合酶（PGHS）是合成前列腺素的關(guān)鍵酶［19］，其可能間接對(duì)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)起重要作用。

3.2.3 α7煙堿型乙酰膽堿受體

在探究激活α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAchR）對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的作用及可能機(jī)制后發(fā)現(xiàn)，與氧糖剝奪組相比，PNU－282987可提高大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率、降低LDH的含量、抑制大腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、降低ROS產(chǎn)量（P< 0.05），同時(shí)使HO－1 蛋白的表達(dá)顯著升高、HIF－1α蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）［20］。這些結(jié)果均表明激活α7煙堿型乙酰膽堿受體具有抗大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷作用，該作用可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)，進(jìn)而對(duì)阿爾茨海默病的發(fā)生起到一定的調(diào)節(jié)作用。

3.2.4 羧酸酯酶2

羧酸酯酶（CES）是一類藥物代謝I相酶，屬絲氨酸水解酶家族，廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，是大部分前藥代謝活化過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵性酶類。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)肥胖、糖尿病患者CES2 表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明糖尿病和羧酸酯酶2 之間存在某種關(guān)聯(lián)［21］，而決定糖尿病是否發(fā)生的關(guān)鍵性因素——胰島素，和阿爾茨海默病也有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系。因此，可推斷羧酸酯酶2和阿爾茨海默病之間可能存在著某些關(guān)聯(lián)。

3.3 生物富集分析

為了討論牛黃對(duì)AD 作用的分子機(jī)制，筆者通過(guò)KOBAS 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)牛黃活性成分與疾病的交集基因CHRM3、CHRM1、CCND2、MTTP 和BCL2 共5 個(gè)基因進(jìn)行了KEGG 富集通路分析。在給定路徑中觀察至少m個(gè)疾病相關(guān)基因的P值可按照公式1 進(jìn)行計(jì)算，其中m是疾病相關(guān)基因數(shù)，M是與給定疾病相關(guān)的基因總數(shù)，N是已經(jīng)科學(xué)驗(yàn)證的基因數(shù)量，n是通路中的基因數(shù)量［22］。P值越小，表示與疾病相關(guān)的基因列表在這一途徑中的比例越高，一般認(rèn)為相關(guān)通路的統(tǒng)計(jì)顯著性閾值為P<0.05 即可表示否定無(wú)效，假設(shè)的兩組差別有顯著意義。

因此，筆者在不同的集群中均選取P<0.05 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中每個(gè)集群僅顯示富集率最高的5 條通路，最終共得到16 條通路，分別為膽堿能突觸［hsa04725］、胃酸分泌［hsa04971］、味覺(jué)傳導(dǎo)［hsa04742］、胰島素分泌［hsa04911］、唾液分泌［hsa04970］、刺猬信號(hào)通路［hsa04340］、凋亡－多物種［hsa04215］、p53 信號(hào)通路［hsa04115］、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）［hsa05014］、麻疹［hsa05162］、催乳素信號(hào)通路［hsa04917］、細(xì)胞周期［hsa04110］、FoxO 信號(hào)通路［hsa04068］、Hippo 信號(hào)通路［hsa04390］、細(xì)胞凋亡衰老［hsa04218］及氨酰tRNA 生物合成［hsa00970］。筆者通過(guò)參考各種文獻(xiàn)，確定了目前已經(jīng)證實(shí)的和阿爾茨海默病相關(guān)的通路共10 條，分別為膽堿能突觸、胰島素分泌、刺猬信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、肌萎縮側(cè)索硬化癥、細(xì)胞周期、FoxO 信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡衰老和氨酰tRNA生物合成。

3.3.1 膽堿能突觸

阿爾茨海默病是最常見的年齡相關(guān)神經(jīng)退行性疾病。其特征是出現(xiàn)β－淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié)積聚，這最終會(huì)導(dǎo)致基底前腦膽堿能神經(jīng)元的減少［23］。膽堿能突觸在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在，它們?cè)谇鹉X、紋狀體、邊緣系統(tǒng)和新皮質(zhì)的高密度表明膽堿能傳遞可能在學(xué)習(xí)記憶、注意力和其他高級(jí)腦功能等方面發(fā)揮著中流砥柱的作用。而膽堿酯酶抑制劑可顯著增加乙酰膽堿在大腦中的有效含量，是臨床上證明可用于治療阿爾茨海默病的少數(shù)藥物療法之一，可見膽堿能系統(tǒng)是該病的重要治療靶點(diǎn)［24］。

3.3.2 胰島素分泌

越來(lái)越多的證據(jù)表明阿爾茨海默病、葡萄糖代謝、胰島素活性和記憶之間存在潛在的聯(lián)系。微管相關(guān)蛋白tau（MAPT）主要是微管動(dòng)力學(xué)和組裝以及神經(jīng)突起生長(zhǎng)所必需的微管蛋白結(jié)合蛋白。而胰島素信號(hào)對(duì)突觸可塑性和記憶形成非常重要，因此可推斷其對(duì)正常的大腦功能至關(guān)重要［25］。最近，tau 被認(rèn)為是胰島素信號(hào)的重要調(diào)節(jié)者，有證據(jù)表明tau與大腦和外周胰島素抵抗以及β細(xì)胞功能障礙有關(guān)。反過(guò)來(lái)說(shuō)，胰島素抵抗也會(huì)導(dǎo)致tau 功能障礙，出現(xiàn)身體功能的惡性循環(huán)［26］。也有實(shí)驗(yàn)研究表明，在AD 患者中，胰島素抵抗與血漿胰島素水平升高和第一時(shí)相胰島素分泌降低可能與AD的發(fā)生有關(guān)［27］。因此，可得出阿爾茨海默病的發(fā)生和胰島素分泌這條通路密切相關(guān)這一結(jié)論。

3.3.3 刺猬信號(hào)通路

已有實(shí)驗(yàn)證明了PN－1 可通過(guò)阻斷刺猬信號(hào)通路，減少海馬神經(jīng)元凋亡，提高空間學(xué)習(xí)記憶能力，從而對(duì)AD 起到保護(hù)作用。刺猬信號(hào)通路可通過(guò)機(jī)體的一些途徑導(dǎo)致阿爾茨海默病的產(chǎn)生，深入研究這條通路可對(duì)阿爾茨海默病的治療起到一定作用［28］。

3.3.4 p53信號(hào)通路

TREM2 突變可引起神經(jīng)退行性疾病，可初步判斷其與阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。通過(guò)體外誘變等報(bào)告分析，證實(shí)了TREM2 啟動(dòng)子中存在p53 RE。此外，CHIR－98014 這種特異性抑制劑，可強(qiáng)烈抑制p53 激活TREM2 和酪氨酸bp。由此可得出：TREM2 是一個(gè)直接的p53 靶基因，阿爾茨海默病的抑制可通過(guò)作用于p53通路的TREM2進(jìn)而進(jìn)行調(diào)節(jié)［29］。

3.3.5 肌萎縮側(cè)索硬化癥

細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥在阿爾茨海默?。ˋD）和肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。通過(guò)建立發(fā)現(xiàn)的某些細(xì)胞因子與神經(jīng)退行性疾病之間的聯(lián)系，可推斷腦脊液炎性細(xì)胞因子可能在未來(lái)被用作這些疾病的生物標(biāo)志物［30］。肌萎縮側(cè)索硬化癥的病因——細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥，可能間接對(duì)阿爾茨海默病的發(fā)生起到一定的推動(dòng)作用。

3.3.6 細(xì)胞周期

通過(guò)異常的細(xì)胞周期再發(fā)生，以及慢性氧化損傷阻止細(xì)胞凋亡，神經(jīng)元獲得了類似于腫瘤細(xì)胞的“永生”，即會(huì)在整個(gè)腦組織中形成并產(chǎn)生老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)［31］。新證據(jù)表明，異常的細(xì)胞周期重入可能在β 誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中起著核心作用。一些信號(hào)介質(zhì)，如Id1、缺氧誘導(dǎo)因子－1（HIF－1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶－5（CDK5）和音速刺猬信號(hào)通路（Shh），可能有助于有絲分裂后神經(jīng)元中β 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期重入。此外，Id1 和CDK5/p25 能夠相互拮抗對(duì)方的活性［32］。因此，Id 蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期在AD 的防治中發(fā)揮潛在的臨床應(yīng)用，即細(xì)胞周期對(duì)阿爾茨海默病的產(chǎn)生有一定的調(diào)節(jié)作用。

3.3.7 FoxO信號(hào)通路

氧化應(yīng)激是阿爾茨海默病發(fā)病的一個(gè)重要決定因素，氧化應(yīng)激可能促進(jìn)FoxO 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致高血糖和活性氧（ROS）的進(jìn)一步增加，即FoxO 蛋白可能為AD的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)［33］。

3.3.8 Hippo信號(hào)通路

AD 的根本原因之一是產(chǎn)生疏水性淀粉樣β42（Aβ42）肽，這些肽聚集形成淀粉樣斑塊。這些斑塊誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和異常信號(hào)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和其他與神經(jīng)退行性變相關(guān)的病理過(guò)程。通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知，Hippo 通路在對(duì)抗Aβ 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，靶向Hippo 信號(hào)可能是治療AD 的有前景的治療方法［34-35］。

3.3.9 衰老細(xì)胞凋亡

衰老是癡呆相關(guān)神經(jīng)退行性變的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，在持續(xù)的壓力下，大部分細(xì)胞均可導(dǎo)致慢性衰老，其特征是促炎癥分子的分泌，促進(jìn)組織和器官的功能衰退。切除衰老細(xì)胞被認(rèn)為是一種有希望的治療手段，可以針對(duì)衰老表型，預(yù)防或減輕與衰老相關(guān)的疾病，即有可能成為治療阿爾茨海默病的新興手段［36］。

3.3.10 氨酰tRNA生物合成

一些標(biāo)記神經(jīng)退行性病變的蛋白質(zhì)，如tau缺乏色氨酸。TrpRS 以細(xì)胞質(zhì)（WARS）和線粒體（WARS2）形式存在，這兩種形式的致病基因變體導(dǎo)致TrpRS 缺乏，從而導(dǎo)致人類智力和運(yùn)動(dòng)障礙。AD 患者色氨酸依賴性蛋白質(zhì)生物合成的減少證明了基于模型的疾病概念，即色氨酸t(yī)RNA 合成酶缺乏極有可能導(dǎo)致阿爾茨海默?。?7］。

4 結(jié)論與展望

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠反映和闡明藥物化學(xué)成分－多個(gè)靶點(diǎn)－多種疾病之間的相互關(guān)系，并根據(jù)這種三通路關(guān)系建立網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)模型，從系統(tǒng)的角度說(shuō)明中藥牛黃對(duì)人體生物網(wǎng)絡(luò)的作用，這個(gè)構(gòu)建體系與中醫(yī)藥多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療方法不謀而合。但是，單純用傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)某種中藥的精確作用機(jī)制相對(duì)困難。

本篇研究通過(guò)對(duì)牛黃活性成分靶點(diǎn)和阿爾茨海默病的靶點(diǎn)進(jìn)行收集和作圖，得到兩個(gè)對(duì)疾病有一定作用的活性成分靶點(diǎn)，這兩個(gè)靶點(diǎn)指向同一活性成分，表明牛黃通過(guò)這個(gè)成分治療阿爾茨海默病。

以前對(duì)藥物的研發(fā)主要遵循“一個(gè)藥物對(duì)應(yīng)一個(gè)基因進(jìn)而治療一種疾病”這種一一對(duì)應(yīng)的模式，這是導(dǎo)致絕大多數(shù)新藥在臨床試驗(yàn)中失敗的主要原因。實(shí)際上，臨床上的多種慢性病如阿爾茨海默病、糖尿病、心腦血管疾病等都是多基因、多因素、多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，僅根據(jù)單一作用靶點(diǎn)很難將機(jī)體各方面進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而達(dá)到良好治療的效果。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)形成藥物－成分－疾病靶點(diǎn)－疾病的新模式，是發(fā)展創(chuàng)新藥物的重要途徑。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的誕生，我們便可借助于現(xiàn)代化軟件技術(shù)將藥物研發(fā)模式進(jìn)行研究與改進(jìn)，逐漸轉(zhuǎn)變常規(guī)的研發(fā)理念，從多靶點(diǎn)與復(fù)雜疾病交互成網(wǎng)這一角度，通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)模擬構(gòu)建藥物與疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，增強(qiáng)研究前的篩選數(shù)據(jù)范圍，形成一種新型的藥物研發(fā)模式，以此通過(guò)該模式研制的藥物治療更多疾病。

本研究主要通過(guò)各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘中藥牛黃的活性成分和作用靶點(diǎn)以及疾病AD 的關(guān)鍵作用基因，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子生物學(xué)的研究方法從分子水平為中藥研究提供了相對(duì)科學(xué)可行的理論研究。