歐陽峰松 向忠軍 熊瑛 丁樂 劉桐言

(1新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410219；2長沙醫(yī)學院中醫(yī)學院)

膝骨關節(jié)炎是一種慢性關節(jié)疾病，以軟骨下硬化、軟骨侵蝕、骨贅形成等病理變化為特征〔1〕。受我國人口老齡化和肥胖人數(shù)增加的影響，膝骨關節(jié)炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢〔2〕；世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結果顯示，全球范圍內60歲以上老年人中10%患有膝骨關節(jié)炎，主要表現(xiàn)為關節(jié)僵硬、疼痛，嚴重影響日常生活質量，是主要致殘原因之一〔3〕。手術治療和藥物保守治療能夠有效延緩膝骨關節(jié)炎的發(fā)展，但長期服用非甾體抗炎藥、軟骨保護劑的療效不佳，胃腸道不良反應較為明顯〔4〕。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學將骨關節(jié)炎歸為“痹癥”的范疇，治療以溫通化瘀為主。三棱莪術湯最早見于《經驗良方》中的三棱丸，可破血逐瘀，常用于治療婦科疾病〔5〕，該方亦能夠體現(xiàn)中醫(yī)治療骨關節(jié)炎的整體觀念，但目前尚無治療膝骨關節(jié)炎的研究報道。本課題組前期基于網絡藥理學研究結果發(fā)現(xiàn)，炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(INF)-γ、白細胞介素(IL)-17可能參與膝骨關節(jié)炎的發(fā)生與進展。本研究旨在探討三棱莪術湯對膝骨關節(jié)炎大鼠模型的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級SD大鼠72只，12周齡，體重160～200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SYXK(湘)2019-0017。飼養(yǎng)條件：溫度20～24℃，濕度50%～60%，每日燈光照明12 h，模擬晝夜交替，自由飲水和進食。

1.2實驗藥物及主要試劑、儀器 三棱莪術湯制備：三棱10 g，莪術10 g，紅花10 g，沒藥10 g，乳香10 g，丹參15 g，桃仁15 g，赤芍15 g，天花粉20 g，加入3 L水，加熱煮至1 L，進一步濃縮成10 g/ml。塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20140072，0.2 g)溶于0.9%氯化鈉溶液。Trizol試劑盒購于上海通蔚生物有限公司；鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)1單克隆抗體，鼠抗人核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3多克隆抗體，鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購于廣州泛思生物有限公司；TNF-α、INF-γ、IL-17 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購于上海百千生物有限公司，VeritiPro熱循環(huán)儀購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司，TGL-16E高速冷凍離心機購于濟南愛來寶儀器設備有限公司，手持式組織勻漿機購于美國Biospec公司。

1.3造模與分組給藥 模型組、塞來昔布組、三棱莪術湯不同劑量組全麻后固定在手術臺，左后肢膝關節(jié)內側備皮，髕骨內側縱切口，剪斷膝關節(jié)內側副韌帶和前后交叉韌帶，并去除半月板。無菌生理鹽水沖洗膝關節(jié)后縫合、包扎、固定，術后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素，劑量為480 mg。根據(jù)成年人給藥劑量估算大鼠用藥量，塞來昔布組、三棱莪術湯不同劑量組造模成功首日開始給藥，塞來昔布組以100 mg/kg劑量灌胃；三棱莪術湯不同劑量組分別以20、40、80 mg/kg劑量灌胃，連續(xù)3個月，對照組和模型組以相同體積生理鹽水灌胃。3個月后測定大鼠機械痛閾和熱刺激潛伏期，進行關節(jié)炎癥積分和光鏡軟骨檢測(Mankin)評分。

1.4標本采集與蘇木素-伊紅(HE)染色 造模3個月后處死各組大鼠，切除左后肢膝關節(jié)脛骨平臺軟骨組織，取其中部分軟骨組織浸于甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋；另外的軟骨組織清潔后放入液氮中保存?zhèn)溆谩Ｈ∈灠鼔K，4 μm連續(xù)切片，二甲苯固定，梯度乙醇脫蠟，蘇木素染色1 min，水洗后用1%氨水返藍1 min，放入伊紅染液中數(shù)秒后水洗，梯度乙醇、二甲苯處理后中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察。

1.5RT-PCR檢測Caspase1、NLRP3 mRNA表達 Trizol試劑盒提取各組膝關節(jié)軟骨組織總RNA，逆轉錄得到cDNA。PCR擴增引物由上海毓秀生物科技有限公司設計合成。Caspase1上游引物：5′-TTATGGAGCCTGGACGTGACCTATGCTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGCATAGGTCACGAC-3′。NLRP3上游引物：5′-AGCCTGGGACGTGACCTATGCTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGGCATAGGAC-3′。GAPDH上游引物：5′-GCAAATGACG CTGAAGGTGGC-3′，下游引物：5′-CCGAGTAGGTA CTGTTGAACGA-3′。PCR體系15 μl，包括dNTP Master Mix 5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、RNA模版 2 μl、蒸餾水6 μl。反應條件：95℃預變性4 min，95℃變性30 s，56℃復性30 s，共40個循環(huán)，72℃延伸1 min。以參照基因GAPDH為標準進行相對定量。

1.6Western印跡檢測Caspase1、NLRP3蛋白表達 苯甲酸磺酰氟裂解液提取各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并將目標蛋白轉移至硝酸纖維素膜，使用含5%牛血清白蛋白的TBST緩沖液室溫下封閉30 min，滴加一抗：鼠抗人Caspase1單克隆抗體(1∶300稀釋)，鼠抗人NLRP3多克隆抗體(1∶500稀釋)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵培育過夜；次日加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)，室溫下孵育1 h，電化學發(fā)光法(ECL)顯影，使用Image J軟件讀取目標蛋白的相對水平。

1.7大鼠膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、INF-γ、IL-17表達水平檢測 取各組膝關節(jié)軟骨組織，使用手持式組織勻漿機進行勻漿后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、INF-γ、IL-17表達水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.8統(tǒng)計學分析 使用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析、t檢驗及χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組膝骨關節(jié)炎癥狀評價指標比較 模型組機械痛閾、熱刺激潛伏期明顯低于對照組，關節(jié)炎癥積分、Mankin評分明顯高于對照組(P<0.01)；塞來昔布組、三棱莪術湯不同劑量組機械痛閾、熱刺激潛伏期明顯高于模型組，關節(jié)炎癥積分、Mankin評分明顯低于模型組(P<0.05)；隨著三棱莪術湯劑量的增加大鼠機械痛閾、熱刺激潛伏期逐漸提升，關節(jié)炎癥積分、Mankin評分逐漸降低，其中80 mg/kg組與塞來昔布組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組膝骨關節(jié)炎癥狀評價指標比較

2.2各組膝關節(jié)軟骨病理學改變情況 對照組膝關節(jié)軟骨組織無缺損，關節(jié)軟骨和滑膜細胞排列整齊有序，軟骨上層未見血管分布，無炎性細胞浸潤，軟骨下骨結構完整。模型組關節(jié)軟骨細胞層變薄，骨細胞數(shù)量減少，存在凋亡軟骨細胞，滑膜細胞排列紊亂，軟骨下骨管腔增大，有炎性細胞浸潤。塞來昔布組軟骨表面呈毛刺樣特征，軟骨細胞數(shù)量明顯多于模型組，且存在少量分裂情況，滑膜細胞緊密排列，小血管和炎性細胞數(shù)量減少。三棱莪術湯20、40 mg/kg組軟骨表面較模型組平整度明顯提升，存在少量軟骨細胞增殖分裂，炎性細胞數(shù)量減少，分布有小血管。三棱莪術湯80 mg/kg組關節(jié)表面較平整與模型組無明顯差異，炎性細胞浸潤不明顯，軟骨細胞處于增殖狀態(tài)，可見小血管。見圖1。

圖1 各組膝關節(jié)軟骨病理學改變情況(HE染色，×200)

2.3各組Caspase1、NLRP3 mRNA和蛋白表達水平比較 模型組Caspase1、NLRP3 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.01)；塞來昔布組、三棱莪術湯不同劑量組明顯低于模型組(P<0.05)；隨著三棱莪術湯劑量的增加均逐漸降低，其中80 mg/kg組與塞來昔布組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4各組TNF-α、INF-γ、IL-17表達水平比較 模型組TNF-α、INF-γ、IL-17表達水平明顯高于對照組(P<0.01)；塞來昔布組、三棱莪術湯不同劑量組均明顯低于模型組(P<0.05)；隨著三棱莪術湯劑量的增加均逐漸降低，其中80 mg/kg組與塞來昔布組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組Caspase1、NLRP3 mRNA和蛋白表達及TNF-α、INF-γ、IL-17表達水平比較

3 討 論

骨關節(jié)炎屬中醫(yī)學“痹癥”的范疇,病因為氣血痹阻，筋骨失養(yǎng)，肝腎虧損，寒凝血瘀，極虛極實，纏綿難愈；病機多因肝腎虧虛,兼夾勞損或風寒濕邪入侵所致,局部氣血瘀滯,不通則痛?！端貑枴け哉摗吩弧帮L、寒、濕三氣雜至,合而為痹”“痹在于骨則重,在于脈則血凝而不流,在于筋則屈不伸,在于肉則不 仁”；《素問·長刺節(jié)論》曰“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹”；《景岳全書》亦曰“痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而為病也”。而三棱莪術湯中的三棱苦平辛散，入肝脾血分，為血中氣藥，長于破血中之氣，能夠破血祛瘀、行氣止痛；莪術苦辛溫香，入肝脾氣分，為氣中血藥，善破氣中之血，可破血行氣，消積止痛〔6〕。二藥伍用，氣血雙施，活血化瘀、行氣止痛、化積消塊力彰。故臨床上常將三棱與莪術配伍，在行血氣的同時還能夠破氣中之血，提升活血、理氣、化瘀的功效。三棱莪術湯已廣泛用于子宮肌瘤、卵巢癌、子宮內膜異位癥、消化道腫瘤的治療〔7～9〕，但對膝骨關節(jié)炎療效和作用機制的研究仍未見報道。本研究結果提示三棱莪術湯能夠有效減輕膝骨關節(jié)炎的軟骨損傷程度，其中80 mg/kg劑量效果最為明顯。進一步通過HE染色觀察大鼠膝關節(jié)軟骨病理學改變，結果顯示，三棱莪術湯能夠明顯降低炎性細胞浸潤水平，減輕膝骨關節(jié)炎軟骨細胞的損傷程度，促進軟骨細胞增殖、分裂。

Caspase1是Caspase家族首個被發(fā)現(xiàn)的成員，能夠激活水解IL-18、IL-1β后啟動病理級聯(lián)反應，包括軟骨基質金屬蛋白酶激活等，進而降解關節(jié)軟骨基質膠原〔10〕。相關研究顯示，Caspase1誘發(fā)的軟骨基質降解能夠間接促進軟骨細胞凋亡，破壞軟骨細胞穩(wěn)態(tài)進而損傷膝骨關節(jié)〔11，12〕。NLRP3炎性小體能夠刺激炎性介質釋放參與多種關節(jié)炎性疾病的發(fā)生與發(fā)展，可作為膝骨關節(jié)炎的潛在生物標志物〔13〕；通過抑制NLRP3表達能夠緩解膝骨關節(jié)炎患者病情。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體激活后可活化下游Pro-Caspase1，被剪切成Caspase1發(fā)揮生物學作用，激活下游炎性因子，發(fā)揮炎癥級聯(lián)反應〔14〕。NLRP3/Caspase1信號通路在全身性炎癥反應和局部炎癥反應中起重要作用〔15〕。本研究結果提示NLRP3/Caspase1信號通路參與了膝骨關節(jié)炎軟骨損傷過程，且可能為三棱莪術湯治療膝骨關節(jié)炎的靶點之一。

TNF-α、INF-γ能夠干擾軟骨組織中膠原和蛋白聚糖的合成，并加速膠原和蛋白聚糖的分解，促進膝骨關節(jié)炎的軟骨破壞〔16〕。相關研究顯示，TNF-α能夠上調滑膜細胞的基因表達，促進成纖維細胞增殖，進而使關節(jié)液中細胞因子水平上升，滑膜組織纖維變性加快，是膝骨關節(jié)炎病變過程的主要因子〔17〕。在膝骨關節(jié)炎大鼠模型中對軟骨基質和細胞進行染色，INF-γ及其受體共同呈陽性表達，且INF-γ濃度與膝骨關節(jié)炎嚴重程度呈正相關〔18〕。IL-17能夠通過影響巨噬細胞、IL-6、IL-8等多種細胞因子表達來參與膝骨關節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，滑膜細胞中IL-17表達可影響IL-8和IL-1β水平，同時增加一氧化氮的合成量〔19〕；IL-17還能與IL-6聯(lián)合上調骨細胞中前列腺素(PG)E2和環(huán)氧酶(COX)-2表達，導致自由基失衡〔20〕。相關研究顯示，TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-17等多種炎癥因子表達受NLRP3/Caspase1信號通路調控〔21〕。本研究結果提示三棱莪術湯可能通過抑制NLRP3/Caspase1信號通路進而抑制下游炎癥因子TNF-α、INF-γ、IL-17表達，達到減輕膝骨關節(jié)炎軟骨損傷的作用，其中80 mg/kg給藥劑量的效果最為明顯。